Comparação da resposta imunológica à toxina botulínica tipo A na pele antes e após o tratamento da hiperidrose axilar

Recebido em: 10/08/2009
Aprovado em: 15/10/2009
Declaramos a inexistência de conflitos de interesse.

Abstract

Introdução:Há relatos de casos publicados e não publicados sobre rash cutâneo, erupcoes acneiformes e desenvolvimento de Herpes simples em pacientes injetados com toxina botulinica para tratamento de rugas faciais e hiperidrose. Foi realizada uma pesquisa para determinar se há alteração imunológica na pele de pacientes tratados pela primeira vez com esta toxina. Métodos: Foi avaliada a resposta imunologica a toxina tipo A na pele de 15 pacientes com hiperidrose axilar antes e apÓs sua aplicaÇÃo. Os seguintes marcadores imuno-histoquimicos foram utilizados para definir o perfi l imunológico local antes e depois da aplicação de toxina botulinica: CD4+, CD8+, CD1a, CD25, anti-TNF-ƒ¿, HLA-DR, ICAM-1, anti-IFN-ƒÁ e anti-IL-4. Resultados e discussão: Realizou-se análise estatística descritiva de cada marcador, e os dados obtidos foram avaliados pelo teste dos sinais de Wilcoxon. Conclui-se que não houve alteração na pele após o tratamento da hiperidrose com toxina botulinica A quando comparados os marcadores.

Keywords: AXILAR, HIPERIDROSE, RESPOSTA IMUNOLÓGICA, TOXINAS BOTULÍNICAS, TRATAMENTO DE HIPERIDOROSE

INTRODUÇÃO

As complicações mais frequentes decorrentes do uso de toxina botulínica e de sua aplicação com fins cosméticos descritas na literatura médica incluem equimose, hematoma, dor, desconforto ou sensação de peso na testa, erupções acneiformes, cefaleia, parestesia, ptose do supercílio, conjuntivite, visão embaçada, fotofobia, diplopia, edema, pápula eritematosa transitória, sensação de corpo estranho nos olhos, enxaqueca, estrabismo, disfagia e lacrimejo.^1,2 As complicações eventualmente advindas do tratamento da hiperidrose incluem fraqueza muscular, parestesia, hiperidrose compensatória, equimose, hematoma, dor e outras que se devem à técnica anestésica escolhida e utilizada pelo médico.^3-5 As complicações relacionadas a outros tratamentos incluem hipocromia,⁶ dor, paralisia facial, epifora, dificuldade de mastigação, ectropio, entropio, conjuntivite, visao embacada, fotofobia, diplopia, conjuntivite, equimose, hematoma, edema, sensação de corpo estranho nos olhos, diarreia, enxaqueca, tosse, disfonia, epistaxe, infeccao urinaria, estrabismo, lacrimejamento, fraqueza muscular (fibrose e atrofia muscular), alterações musculares decorrentes de aplicação incorreta, gosto metálico, trauma neural transitorio, hipotonia, dor cervical, obstrucao respiratoria, xerostomia e disfuncao da bexiga.^7-13 Finalmente, os sintomas sistemicos descritos incluem fraqueza geral, boca e olhos secos, retencao urinaria, sensacao de frio, sintomas da sindrome de botulismo,¹⁴ fadiga, nausea, vômito, exantema da pele, formacao de anticorpos, alergia a albumina, crise miastenica, sindrome neuromuscular,^{11,12,13 15-18} reação tipo I12 e faciite necrotizante.¹⁹

Alguns medicamentos contem albumina humana, e o risco de contaminação e transmissão de doenças virais, inclusive da doença de Creutzfeldt-Jakob, não pode ser descartado.²⁰ A utilização em larga escala desse medicamento para o tratamento de varias doenças dermatológicas, até mesmo para a melhora das linhas faciais hipercineticas, tem despertado curiosidade sobre as alterações imunológicas que podem ocorrer na pele.

Foi realizado estudo e comparação da repercussão imunológica da toxina botulinica tipo A na pele, antes e apos sua aplicacao no tratamento de hiperidrose axilar. Para esse estudo, utilizaram-se os marcadores imuno-histoquimicos anti-CD1a, CD4+, CD8+, CD25, TNF-ƒ¿, HLA-DR, ICAM-1, IFN-ƒÁ e IL-4. Foi escolhida essa doenca e o local de tratamento pela simplicidade e rapidez da tecnica, baixa morbidade, resposta de todos os pacientes ao tratamento e possibilidade de realizacao de biopsia cutanea em uma area nao exposta. Todos os pacientes aceitaram participar desse estudo.

METÓDOS

Este foi um estudo quase-experimental de coorte, nao randomizado. Quinze pacientes com hiperidrose axilar foram selecionados para tratamento apos terem sido informados sobre a terapia, as consultas de acompanhamento e como as bio-psias seriam realizadas. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento, tendo sido o protocolo aprovado pelo Comite de Etica em Pesquisa da instituicao. Dos 15 pacientes, 14 eram do sexo feminino e um do sexo masculino, na faixa etaria de 19 a 56 anos (media de 33,5 anos). Apos o diagnostico de hiperidrose, demarcamos a area axilar comprometida com o teste de Minor.^2,5,21-23

A toxina botulinica foi diluida com 4 mL de soro fisiologico imediatamente antes do tratamento. Foram injetadas intradermicamente (utilizando seringas de 1 mL e agulhas de 30 G .) duas unidades por ponto.^1,3,24,26-29Essa diluicao corresponde a razao de duas unidades de toxina para cada 0,08 mL de solucao. A distancia mantida entre os sitios de injecao foi de 1,5 cm,^30-33 e a tecnica de injecao utilizada e descrita na Figura 1.

Na primeira etapa da pesquisa, injetamos toxina botulinica na axila esquerda e realizamos biopsia da pele normal da prega axilar direita. Trinta dias apos a primeira injecao, tratamos a axila direita e realizamos biopsia da pele da prega axilar esquerda previamente tratada.

Técnica de Congelamento

O fragmento de biopsia a ser enviado para avaliacao imuno-histoquimica foi colocado sobre um suporte de cortica e revestido com uma solucao crioprotetora (Tissue-Tek - Milles Laboratories, EUA). Em seguida, o fragmento foi gradualmente congelado em um frasco contendo isopentano liquefeito (Reagen), em um ambiente de nitrogenio liquido, embrulhado em papel-aluminio e mantido em nitrogenio liquido ate o processamento.

Técnica de Imuno-histoquimica

A tecnica de imunoperoxidase em tecido criopreservado foi usada e ajustada. Essa e a tecnica atualmente aplicada pelo Laboratorio de Dermatologia Tropical de Sao Paulo (HCFMUSP). Os fragmentos de pele congelados foram submetidos a criomicrotomia para obter fragmentos de 4 ƒÊm de espessura, coletados com laminas de vidro revestidas com solucao adesiva de 3-aminopropiltrietoxisilano (Sigma Chemical Co., St Louis, MO/EUA, codigo A3648), procedimento seguido de fixacao com acetona anidra, pro-analise, por dez minutos, em temperatura ambiente. Apos a fixacao, os especimes foram submetidos a reacao imuno-histoquimica com o metodo do complexo estreptavidina-peroxidase (modificado de HSU, 1981).³⁴ O material foi lavado com agua destilada e imerso em Tris-HCL (hidroximetilaminometano . acido cloridrico) e tamponado a um pH de 7,4 por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a peroxidase endogena foi bloqueada com peroxido de hidrogenio (3% em Tris-HCl) e o fragmento foi submetido a tres imersoes em tampao Tris-HCl por cinco minutos. A area em torno do fragmento foi enxuta, e o anticorpo primário, diluido em albumina bovina serica (ABS), foi adicionado em gotas. As diluicoes dos anticorpos primarios foram padronizadas com o uso de fragmentos de pele de psoriase (para anticorpos anti-ICAM-1 e anti-CD1a) e de extratos tonsilares obtidos apos tonsilectomias eletivas para os anticorpos anti-CD4+, anti-CD8+ e anti-HLA-DR. O material foi incubado durante a noite em camara umida e, no dia seguinte, os especimes foram submetidos a tres imersoes em Tris-HCl, por cinco minutos. Apos a secagem da area em torno do fragmento, o anticorpo secundario biotinilado foi gotejado; isto e, a anti-imunoglobulina G de rato foi produzida em coelhos para os seguintes anticorpos: anti-ICAM-1 (DAKO, codigo M7063, titulacao 1/100), anti-HLA-DR (DAKO, codigo M704, titulacao 1/150), anti-CD4+ (DAKO, codigo M0716, titulacao 1/100), anti-CD8+ (DAKO, codigo M7103, titulacao 1/100), anti-CD1a (DAKO, codigo M721, titulacao 1/100), anti- CD25 (DAKO, codigo M0731, titulacao 1/20), anti-TNF-ƒ¿ (Santa Cruz, codigo SC-1350, titulacao 1/50, IFN-ƒÁ (R&D, codigo AF285-NA, titulacao 1/20) e para o anticorpo anti- LihL-4 (R&D, codigo AF204-NA, titulacao 1/20).

Após a imersao dos especimes em Tris-HCL (tres alteracoes em cinco minutos), a area que circunda o fragmento foi seca. O complexo terciario estreptavidina-biotina-peroxidase (complexo binario StrepABC/HRP, rato/coelho, Dako, codigo KO492) foi colocado em uma diluicao de 1:500, e os especimes foram incubados em camara umida, por uma hora, a ^35-37 ‹C. Após essa etapa, eles foram imersos em Tris-HCL tres vezes em cinco minutos.

O desenvolvimento da reacao de imunoperoxidase ocorreu com uma solucao de 0,006%, 3,3 cloridrato de diaminobenzidina (DAB) (Sigma Chemicals, codigo D-5637/D-8001) em um tampao de Tris-HCL, acrescido de 600 ƒÊL de peroxido de hidrogenio 20 volumes (H2O2/20 v), por tres minutos. Apos coloracao, os especimes foram lavados em agua destilada. Realizou-se contracoloracao com hematoxilina de Carazzi por um minuto, e os especimes foram lavados novamente por cinco minutos.

O material foi desidratado em uma cadeia ascendente de alcool etilico, diafanizado em xilol e revestido com uma resina sintetica Permount (Fisher Scientific Fair Lawn, NJ/EUA, codigo SP15-100) e uma laminula. O controle positivo da reacao foi obtido por meio da observacao dos fragmentos de controle (pele psoriasica e tonsila), concomitantemente com o material que estava sendo estudado. O controle negativo das reacoes foi indicado pela ausencia de anticorpos primarios, que foram substituidos pelo tampao Tris-HCl.

Avaliação histomorfometrica dos espécimes coletados

Preparou-se um total de 32 laminas com hematoxilinaeosina para o controle; e 288 laminas foram preparadas por reacoes imuno-histoquimicas. Avaliacoes histomorfometricas foram realizadas utilizando o Kontron Eletronic 300 Image Analysis System. A estacao de trabalho foi composta por um microscopio optico binocular (Zeiss), uma camera de video colorida (Sony CCD-Iris), placa de digitalizacao de imagens, um microcomputador com processador Pentium 133 MHz, IBM-PC compativel, operando em Windows 95 - 32 bits.

As imagens foram digitalizadas com o auxilio de um programa especifico para a analise de imagem (Kontron 300), o que permitiu a partilha de dados com processador de texto (Microsoft Word) e planilha eletronica (Microsoft Excel). A utilizacao desses programas determinou a analise e a interpretacao do tratamento, a aquisicao de valores de medicao das estruturas com todas as variaveis possiveis e a distribuicao automatica de dados gerados pela estacao de analise de imagem para planilhas eletronicas e processador de texto.

Os fragmentos histologicos foram processados no sistema de analise de imagem usando lentes objetivas de 2x e 4x e lentes oculares de 10x. Essa quantificacao foi realizada na menor unidade espacial, denominada pixel. O fator de calibracao (FC) foi calculado automaticamente em pixels e esse fator foi utilizado pelo programa para os calculos correspondentes em micrometros (ƒÊm), de acordo com a calibracao.

A pele representada nos cortes histologicos das amostras foi analisada com avaliacao aleatoria da derme e da epiderme. A fracao da area foi analisada com uma ampliacao de 20x (anti- CD1a, anti-ICAM-1 e anti-TNF-ƒÁ). A contagem de celulas foi realizada por campo, com uma ampliacao de 40x e um total de dez campos por lamina foram contados (anti-CD25, anti- LihL-4, anti-CD4+, anti-CD8+, anti-IFN-ƒÁ e anti-HLADR). A media da contagem desses campos foi utilizada para a obtencao dos resultados finais.

A contagem das estruturas que poderiam ser bem individualizadas. como, por exemplo, celulas CD4+ e CD8+ na juncao dermoepidermica, celulas de Langerhans na area da epiderme, derme ICAM-1 e HLA-DR . foi orientada pelo nucleo da celula. Endotelio vascular corado foi desconsiderado na contagem de ICAM-1 e HLA-DR devido a ocorrencia desse evento na pele normal. A contagem das estruturas individualizadas, como CD-25, anti-LihL-4, anti TNF-ƒ¿ e anti- IFN-ƒÁ, foi orientada por marcadores imuno-histoquimicos no citoplasma. Nesses casos, os nucleos corados foram desconsiderados. A leitura e a contagem foram realizadas por um observador qualificado e bem treinado.

Análise estatística

A análise estatística envolveu a utilizacao de um pacote estatistico denominado SPSS 10.0 for Windows. Realizou-se analise estatistica descritiva para observar frequencia, media, mediana, desvio-padrao e outros parametros; ou seja, as estatis- ticas descritivas mostram mais claramente o comportamento e a distribuicao dos dados. Para a avaliacao das possiveis alteracoes imunologicas na pele de acordo com o aspecto imunohistoquimico, antes e apos a injecao de toxina botulinica do tipo A, a analise estatistica nao parametrica foi utilizada por meio do teste dos sinais de Wilcoxon.^35-36

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As laminas coradas com hematoxilina-eosina mostraram, em todos os casos, presenca de pele normal compativel com a area estudada.

As figuras de 2 a 8 mostram a avaliação e o número de estruturas que podiam ser bem individualizadas; as fotografias sao representacoes dos especimes marcados, indicando as celulas ou areas que foram avaliadas pelo sistema de fotografia digitalizada descrito na secao gMetodosh. As estruturas sao exibidas como a seguir: CD4+ (Figura 2) e CD8+ (Figura 3), linfocitos na juncao dermoepidermica, celulas de Langerhans (Figura 4) na regiao epidermica; ICAM-1 dermica (Figura 5) e HLA-DR (Figura 6) orientada pelos nucleos celulares. CD-25 (Figura 7), anti-LihL-4 (Figura 8), anti-TNF-ƒ¿ e anti- IFN-ƒÁ foram orientados por marcadores imuno-histoquimicos no citoplasma.

Inicialmente, uma análise estatística descritiva foi realizada para cada marcador com valores semelhantes (Tabela I). Posteriormente, os dados foram analisados com o teste dos sinais de Wilcoxon (Tabela II,III,IV). A avaliação dos fragmentos obtidos de pele do paciente, antes e após o tratamento da hiperidrose axilar, resultou nos seguintes dados, de acordo com o aspecto imuno-histológico. A marcação imuno-histoquímica pré-tratamento anti-CD1a mostrou o valor mínimo de células marcadas 0,19 e o máximo de 9,3 células/campo (média de 3,51 células/campo), anti-CD4+, com um mínimo de 12 e um máximo de 199 células/campo (média de 87,6 células/campo), anti-CD8+, com um mínimo de 8 e um máximo de 293 células/campo (média de 84,1 células/campo). A marcação imuno-histológica pós-tratamento anti-CD1a mostrou como valor mínimo de 0,41 célula marcada e o máximo de 7,5 células/campo), anti-CD4 com um minimo de 20 e um maximo de 131 celulas/campo (media de 89 celulas/campo, anti-CD8 +, com um minimo de zero e um maximo de 293 celulas/ campo (media de 83,6 celulas/campo); a avaliacao imunohistoquimica das laminas usando o marcador anti-ICAM-1 na pele pre-tratamento mostrou valor minimo de 0,045 e valor maximo de 1,9 celula/campo (media de 0,62 celula/ campo) e valores pos-tratamento de 0,11 (minimo) e de 1,55 celula/campo (maximo), media de 0,7 celula/campo. Na Tabela I, o nivel de significancia considerado foi de 0,05 nos testes dos sinais de Wilcoxon.

A marcacao pre-tratamento anti-CD25, anti-TNFƒ¿, anti- HLA-DR, anti-IL-4 e anti-IFN-ƒÁ mostrou apenas um caso positivo, sendo o numero de celulas pre-tratamento 30 e postratamento, 2,05 e 6,85, 58 e 64, anti-IL-4, 0 e 85, anti-IFN-ƒÁ, 22 e 26 celulas/campo, respectivamente. Os dados das analises pre e pos-tratamento obtidos com os marcadores anti-CD4+ e CD8+ com o teste dos sinais de Wilcoxon mostram que nao houve diferenca significativa entre pre e pos-tratamento (Tabela II).

Ao analisar os dados em detalhes, observamos reducao na variabilidade (ver desvio-padrao) para os marcadores, exceto para o anti-CD1a expresso na derme. Outro modo de observar esse resultado quando apenas o marcador anti- CD1a e analisado: os valores minimo e maximo alteram significativamente, reduzindo assim a dispersao de dados. No entanto, se aplicarmos o teste para analisar as medias, chegaremos a conclusao de que a resposta para o marcador imuno-histoquimico anti-CD1 na derme antes e apos o tratamento e identica (Tabela III). Ao aplicarmos o teste t de Student, tambem concluimos que nao ha diferenca significativa entre os resultados obtidos. Para os marcadores anti-TNF-ƒ¿, anti-CD25, anti-HLA-DR, anti-LihL-4, IFN-ƒÁ e anti-ICAM-1 na epiderme, nenhuma conclusao foi obtida com base nos dados coletados, ja que os resultados obtidos foram negativos em quase todas as laminas analisadas. A analise dos dados pre e pos-tratamento obtidos com o marcador anti-ICAM-1 na derme por meio do teste dos sinais de Wilcoxon nao mostrou diferenca significativa em ambas as fases (Tabela IV).

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

As reações imunes foram abordadas sob diferentes aspectos, de acordo com a revisao da literatura, resultando em atualizacao da pesquisa atual e passada. O presente estudo teve como objetivo avaliar possiveis alteracoes na imunidade da pele dos pacientes que receberam injecao de toxina botulinica do tipo A. Ate o presente, nao encontramos na literatura qualquer estudo que tenha abordado tal questao em relacao a acao dessa droga na pele. Encontramos o relato de uma paciente que foi tratada para rugas faciais hipercineticas com toxina botulinica do tipo A por quatro vezes; uma semana depois de cada injecao, inclusive da primeira, a paciente desenvolveu herpes simples na área tratada. Apesar de seu uso em larga escala para o tratamento de rugas de expressao e hiperidrose, nao ha observacao clinica ou laboratorial sobre o que realmente ocorre na pele. Esses fatos despertaram nosso interesse em avaliar o comportamento imunologico na pele antes e apos o uso dessa medicacao.

Neste estudo, a segunda biopsia foi realizada trinta dias apos a injecao da droga, com base em estudos na literatura medica, sugerindo que o processo de reconhecimento e ativacao do sistema imune leva de vinte a trinta dias. Esse periodo e respeitado e, ate o momento, a recomendacao e que a reinjecao de BT deve ser evitada antes desse intervalo, a fim de minimizar a ocorrencia de sensibilizacao.^16,37 Foi demonstrado que a pele nao apresenta qualquer anomalia imunologica causada por injecao das doses utilizadas pela maioria dos medicos para tratar hiperidrose . ao analisarmos os marcadores anti-CD4+, CD8+, HLA-DR, ICAM-1, TNF-ƒ¿, CD25, LihL-4 e IFN-ƒÁ e os marcadores anti-CD1a na epiderme e na derme.

Os imunomarcadores foram escolhidos com o objetivo de definir um perfil da imunidade celular e saber se ha qualquer estimulo humoral nesse tipo de tratamento. Quando analisados separadamente, os pacientes 3 e 4 apresentaram aumento de reacao apos o tratamento, enquanto os pacientes 7, 8 e 11 apresentaram reacao diminuida (Tabela 1).

Haverá diferencas individuais na resposta imunologica da pele apos o tratamento da hiperidrose, em funcao de resposta tanto humoral quanto imunomediada por celulas-T em alguns individuos? E qual sera o comportamento desses pacientes apos a segunda injecao da medicacao? Uma avaliacao mais detalhada seria muito interessante, com a aplicacao do protocolo adotado por Larsen et al. (1990),³⁷ Lukas et al. (1996)³⁸ e Sugiura et al.(2003),³⁹ acompanhando a migracao celular com biopsias apos 24 e 48 horas, alem de avaliacao apos trinta dias. Acreditamos que esse estudo deve ser realizado a partir de nossa investigacao para tentar determinar se ha uma reacao inflamatoria local que seja ou nao dependente de mediadores, ou o nivel de envolvimento das celulas dendriticas epidermicas na intensidade da resposta imune da pele aos agentes quimicos de acordo com Lappin et al. (1996).⁴⁰

Portanto, no presente estudo, concluiu-se que nao houve alteracao na pele, antes ou apos o tratamento da hiperidrose com toxina botulinica do tipo A, quando os marcadores anti-CD4+, anti-CD8+, anti-HLA-DR, anti-ICAM-1, anti- TNF-ƒ¿, anti-CD25, anti-LihL-4, anti-IFN-ƒÁ e anti-CD1a aplicados na epiderme e na derme foram avaliados de acordo com as tecnicas propostas neste estudo.

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