Estudo comparativo para avaliação da eficácia cicatrizante de formulações tópicas contendo Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) em modelo de pele humana nativa

Data de submissão: 16/12/2021
Decisão Final: 16/07/2022

Fonte de financiamento: Estudo patrocinado por Megalabs SAS, Bogotá, Colômbia
Conflito de interesses: Nenhum
Como citar este artigo: Rojas BSM, De-la-hoz JL, Facchini G, Silva GH, Kawakami CM, Pinheiro ALTA, Eberlin S. Estudo comparativo para avaliação da eficácia cicatrizante de formulações tópicas contendo Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) em modelo de pele humana nativa. Surg Cosmet Dermatol. 2022;14:e20220118

Abstract

INTRODUÇÃO: extratos vegetais e ativos derivados de plantas tem sido desenvolvidos com o objetivo de melhorar e potencializar o processo de cicatrização cutânea, dentre eles, o Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare).
OBJETIVO: avaliar o efeito do extrato de grão inteiro (EGTA-PR) e extrato aquoso (EATA-FI) de Triticum aestivum L. na cicatrização cutânea em pele humana ex vivo.
MÉTODOS: fragmentos de pele obtidos de cirurgia plástica eletiva foram submetidos a lesões teciduais e tratados com os extratos durante oito dias para avaliação histológica da reepitelização e marcação proteica do fator de crescimento epidérmico (EGF).
RESULTADOS: EGTA-PR e EATA-FI aceleraram o processo de reepitelização em cultura de pele humana submetida a lesão tecidual. Adicionalmente, foi observado um aumento da marcação proteica de EGF após o tratamento com EGTA-PR.
CONCLUSÃO: EGTA-PR apresentou um melhor desempenho na reepitelização quando comparado ao EATA-FI, pois apresentou uma maior marcação proteica para EGF em cultura de pele humana. Da mesma forma, os resultados histológicos mostraram que a redensificação dérmica obtida com o EGTA-PR foi visualmente superior à observada com EATA-FI. Os resultados obtidos são promissores e corroboram as diversas ações biológicas já reportadas na literatura para extrato de Triticum aestivum L. nas etapas da cicatrização tecidual.

Keywords: Regeneração; Fator de Crescimento Epidérmico; Triticum; Técnicas in vitro; Cicatrização

INTRODUÇÃO

A cicatrização tecidual é um processo dinâmico e complexo, composto de quatro fases: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação do tecido. Após a lesão tecidual, forma-se um coágulo seguido de infiltração de neutrófilos, macrófagos e células endoteliais, que promovem uma resposta inflamatória e imunológica, proporcionando a reconstrução tecidual.¹

Nesse arsenal metabólico, são produzidos citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento que estimulam e ativam a proliferação e migração celular, orquestrando o processo de cicatrização.^1-2 Dentre os fatores de crescimento, destacamos o fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator transformador do crescimento beta (TGF-β), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento para insulina (IGF).^3-4

FGF, TGF-β e PDGF estimulam a infiltração de fibroblastos no local da lesão. O TGF-β e o PDGF também iniciam alterações fenotípicas nessas células, convertendo os fibroblastos em miofibroblastos, que se alinham nas bordas da matriz extracelular, gerando uma força constritiva para o fechamento da ferida.^5-6

Horas após o dano, inicia-se o processo de reepitelização e ocorre a liberação de EGF, TGF-β, FGF e fator de crescimento de queratinócitos (KGF ou FGF7), que atuam estimulando a migração e proliferação de células epiteliais. Uma vez fechada a ferida, os queratinócitos passam pelo processo de estratificação e diferenciação para restaurar a barreira.^7-8

A formação da matriz requer a remoção do tecido de granulação. Em seguida, a estrutura é saturada com proteoglicanos e glicoproteínas. Essa etapa é seguida pela remodelação do tecido envolvendo a síntese de novo colágeno, mediada por TGF-β e clivagem do colágeno antigo por PDGF. O produto final desse processo é o tecido de cicatrização.^7-8

O sucesso da cicatrização depende de fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas envolvidos em uma integração harmônica de sinais que coordenam os processos celulares. Nesse estudo, avaliamos os efeitos de dois produtos fitoterápicos de uso tópico, contendo extratos padronizados da espécie Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) no processo de reepitelização cutânea e produção de fatores de crescimento teciduais, utilizando um modelo experimental de pele humana nativa.

MÉTODOS

Os produtos fitoterápicos de uso tópico contendo extratos padronizados de Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) foram fornecidos por Megalabs SAS, Bogotá, Colômbia. A formulação principal apresenta como ingrediente ativo o extrato de grão inteiro de trigo Triticum aestivum L. (EGTA- PR; PROCICAR REGENERIX^®). Esse extrato é obtido em condições padronizadas de tempo, iluminação e temperatura que favorecem a ativação e germinação de sementes para uma subsequente extração aquosa. Essas condições favorecem a hidrólise enzimática do amido e a produção de oligossacarídeos com determinados pesos moleculares associados à atividade farmacológica. No intuito de comparar as especificidades de cada método de extração, avaliamos em paralelo as respostas biológicas produzidas por uma formulação fitoterápica contendo o extrato aquoso de Triticum aestivum L. (EATA-FI; FITOSTIMOLINE^®).

A pele humana utilizada neste estudo foi proveniente de uma doadora, do sexo feminino, fototipo II, 36 anos, submetida à cirurgia plástica eletiva na região abdominal (abdominoplastia). Após a realização do procedimento cirúrgico, os fragmentos de pele foram coletados em frascos plásticos com solução salina 0,9% e mantidos sob refrigeração por até 24 horas. Este projeto não inclui o armazenamento e estoque de material biológico para seu uso futuro, portanto os fragmentos remanescentes foram devidamente descartados como lixo infeccioso. A aprovação da utilização de fragmentos de pele humana de cirurgia eletiva para este estudo foi dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade São Francisco - SP, CAAE 82685618.9.0000.5514, sob o parecer 2.493.285.

A pele humana foi fracionada em 12 fragmentos de aproximadamente 1,5cm², distribuídos em triplicata para cada um dos quatro grupos experimentais, conforme descrito na tabela 1. O grupo controle basal foi mantido como controle do experimento durante os oito dias de duração, apenas com trocas de meio de cultura a cada 48 horas. O controle positivo contemplou apenas a lesão tecidual, sem tratamento. Os grupos que receberam tratamento com EGTA-PR e EATA-FI foram submetidos a lesões teciduais com bisturi, tratados diariamente com os produtos avaliados na proporção de 25-30mg/cm², e mantidos em incubadora a 37°C na presença de 5% de CO2 durante oito dias consecutivos.

Os fragmentos de pele, que continham lesões teciduais, foram tratados durante todos os dias de incubação. Após esse período, os fragmentos foram submetidos à análise histológica para avaliação da reepitelização epidérmica pela coloração hematoxilina & eosina (Sigma, San Luis, MO, EUA) e para realização do ensaio de imunofluorescência para EGF. Os sobrenadantes das culturas de pele também foram coletados para quantificação de KGF e TGF-β.

Para avaliação histológica, os fragmentos de pele foram incluídos em Tissue-Tek^® O.C.T.^TM e, em seguida, os cortes seriados de 12 mícrons foram coletados diretamente em lâminas silanizadas em criostato (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, EUA). As seções foram lavadas com tampão fosfato e incubadas overnight com anti-EGF (Bioss, Woburn, MA, EUA). Posteriormente, as seções foram enxaguadas novamente e incubadas por uma hora com Alexa Flour 488-Secondary Antibody (Life Technologies, Calsbad, CA, EUA). Uma incubação adicional foi realizada com DAPI (4’-6-diamidino-2-fenilindol; marcador de DNA; Sigma) seguida por lavagens com tampão fosfato.

As lâminas foram preparadas, utilizando-se meios de montagem específicos, e analisadas ao microscópio (Olympus, Tóquio, Japão) usando o software CellSens padrão (^© 2010 Olympus Corporation). A intensidade do parâmetro de fluorescência emitida pela marcação de anticorpos específicos foi avaliada. Após a obtenção das imagens, a intensidade de fluorescência foi quantificada com o auxílio do software ImageJ (versão 1.48; Unidades Arbitrárias - U.A.).

As quantificações de KGF e TGF-β foram realizadas no sobrenadante por meio de ensaio imunoenzimático, utilizando-se kit adquirido comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). A leitura da absorbância foi realizada a 450nm em um monocromador Multiskan GO (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA).

Na avaliação estatística, foi utilizado o teste ANOVA para mensurar a variação dos resultados, comparando-se os dados entre os grupos. Em seguida, foi aplicado o pós-teste de Bonferroni, que fortaleceu e tornou mais preciso o resultado apresentado na ANOVA. Foi utilizado o nível de significância de 5% (GraphPad Prism v6).

RESULTADOS

Na figura 1, apresentamos os resultados obtidos no processo de reepitelização em fragmentos de pele humana nativa submetidos à lesão tecidual e tratados com as formulações EGTA-PR e EATA-FI.

Como podemos observar, os fragmentos de pele submetidos ao corte com bisturi apresentaram uma lesão tecidual na epiderme e derme. Após oito dias de cultura, o grupo submetido somente à lesão apresentou sinal de reepitelização conforme representado pelas setas pretas na figura 1. Entretanto, os fragmentos de pele submetidos a ambos os tratamentos com EGTA-PR e EATA-FI apresentaram uma maior extensão na reepitelização quando comparados ao grupo não tratado. O tratamento com as formulações também demonstrou uma melhora da regeneração dérmica, visualizada por uma redensificação da matriz extracelular, com ênfase para o tratamento com EGTA-PR.

Nas figuras 2 e 3, apresentamos os resultados da imunomarcação e semiquantificação de EGF, respectivamente, em fragmentos de pele ex vivo submetidos à lesão tecidual com bisturi e tratados com as formulações EGTA-PR e EATA-FI.

A figura 3 representa a quantificação da intensidade de fluorescência de EGF por meio de análise das imagens obtidas na figura 2. Podemos observar que os fragmentos submetidos apenas à lesão tecidual com bisturi apresentaram, após oito dias de cultura, uma redução de 57,18% na produção de EGF em relação ao controle basal (P<0,001). O tratamento com a formulação EGTA-PR promoveu aumento de 98,68% (P<0,001) na produção de EGF em relação ao grupo submetido somente à lesão tecidual. Por outro lado, a formulação EATA-FI não apresentou alterações significativas na produção de EGF em comparação ao grupo com lesão tecidual.

DISCUSSÃO

A integridade do tecido cutâneo desempenha um papel vital na interface com o ambiente externo. Portanto, a ocorrência de dano a este órgão pode resultar desde uma cicatriz inestética até a desestruturação sistêmica da saúde do ser que envolve.

Apesar de vários cuidados e tratamentos modernos da pele, nem sempre a cicatrização ocorre de forma harmônica. A recuperação do tecido após um dano é um processo complexo, dependente dos vários tipos celulares e mediadores que interagem em uma sequência temporal altamente sofisticada. É um processo dinâmico, desencadeado em resposta à lesão tecidual, que visa reparar a matriz e os danos celulares e restaurar a integridade da barreira cutânea, passando por quatro fases que se sobrepõem: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelamento.⁹

O processo de cicatrização começa com a fase de hemostasia, que consiste na formação de um coágulo sanguíneo que preenche a lesão, no intuito de estancar o sangramento e preservar as estruturas do tecido. Essa etapa está ligada à formação de uma matriz temporária, à secreção de citocinas e a outros fatores de crescimento que, ao interagirem com os componentes da matriz extracelular (MEC), desencadeiam todo o processo de reparo. Na sequência, a fase inflamatória é iniciada por neutrófilos sob a influência de macrófagos, que limpam o local de bactérias e detritos e liberam citocinas pró-inflamatórias e mais fatores de crescimento, por sua vez, responsáveis pelo recrutamento e ativação de fibroblastos e células epiteliais.¹⁰

A fase proliferativa inicia-se, em média, no terceiro dia da lesão, sendo caracterizada pela reconstrução do tecido lesado e pelo aumento do número de células no local da ferida devido à migração e à proliferação de fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos.¹¹ Durante essa fase, os fibroblastos, na presença dos vasos sanguíneos recém-formados, proliferam-se ativamente e sintetizam componentes da MEC que, além de seu papel estrutural, cumprem uma função de sinalização, regulando as etapas posteriores do remodelamento. Esta última fase ocorre quando a superfície da ferida é contraída, um novo epitélio se desenvolve e o tecido cicatricial final é formado.

Nesse estudo, avaliamos os efeitos de duas formulações tópicas contendo extratos padronizados de Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) no processo de reepitelização cutânea, utilizando um modelo experimental de cultura de pele humana.^12-13 Os resultados mostraram que a formulação contendo o extrato de grão inteiro de trigo Triticum aestivum L. (EGTA-PR) e o extrato aquoso de Triticum aestivum L. (EATA-FI) foram capazes de acelerar o processo de reepitelização após oito dias de tratamento em cultura de pele humana submetida a lesão tecidual. Adicionalmente, foram observados aumento da redensificação dérmica e marcação proteica de EGF, particularmente após o tratamento com o EGTA-PR.

É importante salientar que os resultados obtidos com a formulação contendo o extrato de grão inteiro de Triticum aestivum L. (EGTA-PR) foram mais efetivos do que aqueles contendo o extrato aquoso (EATA-FI) nos parâmetros avaliados neste estudo. Esse fato se deve às particularidades dos diferentes processos de obtenção desses extratos, o que afeta a composição fitoquímica e, consequentemente, a especificidade farmacológica.

Esses achados são importantes para o processo de cicatrização da pele, pois indicam o início de uma fase proliferativa que precede o remodelamento e a formação de um novo tecido.¹⁴ O papel do fator de crescimento epidérmico (EGF) foi extensivamente investigado na cicatrização de feridas normais e patológicas e está implicado na migração de queratinócitos, função de fibroblastos e formação de tecido de granulação.¹⁵

A cicatrização de feridas cutâneas é estudada há décadas, e diversos extratos vegetais e ativos derivados de plantas foram desenvolvidos com o objetivo de melhorar e potencializar o processo reparador. Entre eles, o Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) tem sido amplamente utilizado na medicina tradicional graças às suas propriedades de aceleração do reparo tecidual.^16-20

Diversos estudos mostraram que o extrato de T. aestivum L. foi capaz de induzir a proliferação de fibroblastos e de células endoteliais acelerando o reparo de feridas, em parte devido à presença de malto-oligossacarídeos de peso molecular superior a 1000.^21-25 Essa ação foi confirmada por estudos in vivo em modelos animais, em que o extrato regenerou lesões cutâneas.²⁵ Além das propriedades regeneradoras do extrato, evidências adicionais indicaram sua habilidade em reduzir a resposta inflamatória e prevenir danos teciduais irreversíveis.²⁶

Tito e colaboradores também mostraram uma ação do extrato de T. aestivum L. no estímulo da síntese de fibronectina, componente-chave na formação e organização da matriz extracelular e também da enzima hialuronan sintase 2, precursora do ácido hialurônico.⁹ Esses mesmos autores atribuíram ao extrato a propriedade de restauração da barreira cutânea por meio do aumento da síntese de ceramidas.⁹

Diversos extratos e frações isoladas de T. aestivum L. foram avaliados e confirmaram a habilidade dessa espécie em diferentes mecanismos envolvidos no processo de regeneração tecidual. Contudo, os resultados relatados na literatura e os dados apresentados no presente estudo demonstram que o método de extração aplicado, além da base farmacotécnica, é mandatório na atividade biológica observada, dificultando estudos comparativos de performance.

Os resultados apresentados neste trabalho constituem um estudo preditivo utilizando o modelo experimental de pele humana proveniente de cirurgia plástica eletiva. Esse sistema representa, dentre os métodos alternativos, o de maior proximidade a uma condição real de uso por preservar as características da população celular nativa da pele. Apesar dos resultados promissores obtidos na melhora do processo de reparo tecidual, estudos adicionais nesse modelo, e também clínicos, são necessários para comprovar efetivamente essa ação dos extratos de Triticum aestivum L.

CONCLUSÃO

A rapidez e robustez no processo de reparo tecidual é essencial para formação de uma cicatriz adequada e esteticamente aceitável. Apesar de vários cuidados e tratamentos modernos, o uso de produtos à base de ervas desempenha um papel importante na cicatrização de feridas, especialmente na medicina complementar. Neste trabalho, avaliamos o efeito de dois produtos fitoterápicos de uso tópico contendo extratos padronizados de Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) na cicatrização de feridas, utilizando um modelo ex vivo de reepitelização cutânea. Os resultados permitiram inferir que o extrato de grão inteiro (EGTA-PR) apresentou um melhor desempenho na reepitelização quando comparado ao extrato aquoso (EATA-FI), pois apresentou uma síntese de EGF significativamente maior em cultura de pele humana. Da mesma forma, os resultados histológicos mostram que a redensificação dérmica obtida com o EGTA-PR foi visualmente superior à observada com o extrato aquoso. Embora estudos complementares sejam necessários, os resultados obtidos com o extrato de grão inteiro de trigo Triticum aestivum L. (sinônimo Triticum vulgare) - EGTA-PR; PROCICAR REGENERIX^® - são promissores e corroboram as inúmeras ações biológicas já reportadas na literatura nas etapas da cicatrização tecidual.

CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES:

Brayan Styven Merchan Rojas 0000-0003-4322-1084
Aprovação da versão final do manuscrito; concepção e planejamento do estudo; participação efetiva na orientação da pesquisa; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica do manuscrito.

Jose Luis De-la-hoz 0000-0001-9944-8961
Concepção e planejamento do estudo; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados; revisão crítica do manuscrito.

Gustavo Facchini 0000-0003-0111-7596
Análise estatística; concepção e planejamento do estudo; obtenção, análise e interpretação dos dados.

Gustavo Henrique da Silva 0000-0003-0215-2246
Concepção e planejamento do estudo; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados.

Ana Lúcia Tabarini Alves Pinheiro 0000-0002-0226-2544
Concepção e planejamento do estudo; participação intelectual em conduta propedêutica e/ou terapêutica de casos estudados.

Samara Eberlin 0000-0001-7001-801X
Elaboração e redação do manuscrito; revisão crítica da literatura.

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