Avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro de um produto de administração oral contendo peptídeos de colágeno, delphinol^® vitamina C e hibiscus

Data de submissão: 29/04/2017

Data de aprovação: 02/09/2018

Trabalho realizado na Invitrocell - Invitrocell Avaliação Molecular e Celular Ltda. - Paulínia (SP), Brasil.

Suporte Financeiro: Laboratório Farmoquímica, Rio de Janeiro - RJ, Brasil

Conflito de Interesses: Os autores afirmam não possuir interesses pessoais, comerciais, políticos ou financeiros neste manuscrito

Abstract

INTRODUÇÃO: O termo inflammaging refere-se ao aumento da resposta inflamatória devida ao envelhecimento, resultando em estado pró-inflamatório sistêmico crônico em baixo grau. Ocorrem níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias como interleucina-1, inter-leucina-6 e fator de necrose tumoral. Assim, o uso de ativos que atuam na modulação da resposta inflamatória auxilia na redução do estresse oxidativo celular e também reduz ou evita os danos celulares e moleculares irreversíveis não clinicamente detectáveis.
OBJETIVO: Avaliar a ação de um composto contendo peptídeos de colágeno, delphinol^®, vitamina C e hibiscus na modulação da resposta inflamatória cutânea.
MATERIAL E MÉTODOS: Foi avaliada a liberação das citocinas inflamatórias após tratamento com o produto, em queratinócitos expostos a um lipopolissacarídeo indutor de resposta inflamatória.
RESULTADOS: Quando os queratinócitos foram expostos ao composto em estudo, observaram-se aumento na liberação de interleucina 6 e tendência de redução nos níveis de interleucina 1-alfa e de interleucina-8. Além disso, ficou reduzida em 67,5% (P=0,008) a liberação de fator de necrose tumoral-alfa basal.
CONCLUSÕES: O composto estudado tem efeito potencial sobre o processo de inflammaging e, consequentemente, sobre o envelhecimento, por meio da modulação das citocinas inflamatórias interleucina-1 alfa, interleucina-6, interleucina-8 e fator de necrose tumoral-alfa.

Keywords: Ácido ascórbico; Antioxidantes; Anti-Inflamatórios; Colágeno; Envelhecimento; Envelhecimento da pele; Hibiscus; Mediadores da inflamação; Pele; Suplementos nutricionais

INTRODUÇÃO E OBJETIVO

As citocinas são polipeptídeos ou glicoproteínas extra-celulares, hidrossolúveis. São produzidas por diversos tipos de células no local da lesão e por células do sistema imunológico, pela ativação de proteinoquinases ativadas por mitógenos. As citocinas influenciam a atividade, a diferenciação, a proliferação e a sobrevida da célula imunológica, assim como regulam a produção e a atividade de outras citocinas, que podem aumentar (pró-inflamatórias), como interleucina-1b (IL-1b), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8) e fator de necrose tumoral-alfa (TNFα), ou atenuar (anti-inflamatórias) a resposta inflamatória. TNFα é citocina pró-inflamatória produzida principalmente por monócitos, macrófagos e linfócitos-T, abundantes no peritôneo e no tecido esplâncnico.¹ O envelhecimento é processo biológico complexo e dinâmico caracterizado pela remodelação contínua com reparo do DNA, apoptose, resposta imune, estresse oxidativo e inflamação. Uma das teorias mais recentes sobre o envelhecimento está centrada na resposta imunológica e leva em consideração a ativação de inflamação subclínica e crônica de baixo grau denominada inflammaging.² Tal resposta inflamatória crônica pode acumular-se com o tempo e gradualmente provocar danos nos tecidos. É considerada uma das razões principais de muitas doenças relacionadas com a idade, como diabetes, aterosclerose, degeneração macular e envelhecimento da pele.³ Existem ainda evidências crescentes de que a inflamação desempenha papel importante na doença cardiovascular, podendo ser considerada consequência tardia da programação evolutiva para uma resposta pró-inflamatória.^4-6 O envelhecimento é conduzido pelas citocinas pró-inflamatórias e substâncias produzidas pelo sistema imunológico inato. O sistema de macrófagos e o sistema complemento, dois componentes importantes do sistema imune inato, têm atraído cada vez mais atenção, uma vez que parecem estar envolvidos na patogênese de várias doenças associadas com a inflamação. Estudos revelam que a imunidade inata é importante nesse processo, no qual os fagócitos mononucleares, tais como os macrófagos, desempenham papel fundamental em várias doenças relacionadas à idade. Diversos estudos globais de perfil de expressão genética relacionaram todos os genes do sistema imunológico e da inflamação com o fotoenvelhecimento, independentemente do tipo étnico. O fotoenvelhecimento induzido por UV pode ser visto como envelhecimento prematuro da pele. A radiação UV induz uma série de eventos que podem levar à inflamação, induzindo: a) os queratinócitos epidérmicos a liberar citocinas inflamatórias, como IL-1 e IL-6 e TNF-α; b) os mastócitos a gerar prostaglandinas e outros mediadores inflamatórios, como histamina e leucotrienos; c) a morte celular cutânea; e d) a peroxidação da membrana lipídica. No processo de inflammaging ocorre aumento das reações inflamatórias em decorrência da idade, caracterizado por níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias: IL-1, IL-6 e TNF-α.⁷ A exposição à radiação UV aguda resulta na infiltração dos neutrófilos na epiderme e na derme para depuração de células apoptóticas induzidas por UV e para eliminação de células cutâneas. Sugere-se ainda que algumas enzimas, tais como metaloproteinases de matriz (MMP-1 e MMP-9), contribuam para o processo de fotoenvelhecimento. É provável que os monócitos e macrófagos realmente desempenhem um papel mais importante nesse processo, porque atacam os infiltrados após algumas horas para limpar as células apoptóticas e os lipídeos oxidados.³ A proteína C-reativa (PCR), de fase aguda, produzida pelo fígado em resposta à IL-6, também é marcador útil de inflamação, mais comumente utilizado na prática clínica. Acredita-se que a inflamação seja consequência da exposição cumulativa durante a vida à carga antigênica causada por infecções clínicas e subclínicas, bem como pela exposição a antígenos não infecciosos. A consequente resposta inflamatória, lesão tecidual e produção de espécies reativas de oxigênio que causam danos oxidativos também desencadeiam a liberação de citocinas adicionais, principalmente a partir de células do sistema imune inato, mas também da resposta imune adquirida. Isso resulta em ciclo vicioso, impulsionando o sistema imunológico, remodelando e favorecendo um estado pró-inflamatório crônico, em que alterações fisiopatológicas, lesão tecidual e cura ocorrem simultaneamente. Os danos celulares e moleculares irreversíveis que não são clinicamente evidentes acumulam-se de modo lento ao longo de décadas. A população de células T CD8+ é alterada em maior extensão do que a população de CD4+. Com a idade, aumento no número de células específicas do antígeno é associado a aumento no número de células senescentes terminalmente diferenciadas, que ocupam grande proporção de espaço imunológico. Essas células, particularmente CD8+, são potentes produtores de citocinas inflamatórias e têm sido fortemente associadas com imunidade antiviral reduzida e patologias inflamatórias relacionadas. Essas células específicas produzem mais IL-6 e TNF-α do que seus homólogos mais jovens.^3,7

Este estudo avaliou a atividade anti-inflamatória in vitro da substância teste (complexo nutracêutico, para administração por via oral, contendo peptídeos de colágeno, vitamina C, Hibiscus sabdariffa e Delphinol^® - Exímia Firmalize Age Complex^® Farmoquímica, Rio de Janeiro, Brasil) mediante a modulação da liberação de citocinas inflamatórias IL-1α, IL-6, IL-8 e TNF-α por queratinócitos.

MATERIAL E MÉTODOS

Trata-se de estudo in vitro, comparativo com grupo-controle

Teste de viabilidade celular

Foi realizado teste de viabilidade celular, que determina a maior dose não tóxica a ser utilizada nos experimentos subsequentes. Para tanto, fibroblastos murinos 3T3 Balb/C foram mantidos em cultura e expostos a várias concentrações da substância teste. As culturas foram visualmente examinadas após 24 horas, e o número de células viáveis e/ou o total do conteúdo celular foi determinado pela captação do vermelho neutro (OD 540nm). O número de células na presença da amostra teste foi comparado com aquele observado no controle. A análise do IC50 foi realizada com o software SigmaPlot 9.01 (2004), utilizando equação de curva logística de quatro parâmetros (Curva de Hill). A partir dos dados gerados por essa curva é possível determinar as concentrações não citotóxicas da substância teste.

Teste Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Tratamento das amostras

Células NHK foram semeadas em placas de 24 poços na confluência de 28.500 células por poço. Após 24 horas em incubadora de CO₂, as células foram tratadas com as concentrações testes da substância teste em presença de extrato de Escherichia coli (LPS, contendo 5µg/ml de proteína equivalente) em meio de cultura Epilife Low calcium. O sobrenadante celular foi recolhido após 24 horas de exposição aos tratamentos com a substância teste + LPS e estocadas em freezer a -30°C. A quantidade de IL-1α, IL-6, IL-8 e TNF-α em sobrenadante de cultura de que-ratinócitos humanos primários foi avaliada por Elisa, segundo as especificações do fabricante (IL-1α humano: Thermo Scientic - Cód.: EH2IL1A; IL-6 humano: Sigma-Aldrich - Cód. RAB0306; IL-8/CXCL8 humano: Sigma-Aldrich - Cód. RAB0319; TNF-α humano: Sigma-Aldrich - Cód.RAB0476). Resumidamente, anticorpos específicos fixados em placa de 96 poços e os sobrenadantes, incluindo os padrões de proteína recombinante com concentrações conhecidas de IL-1α, foram aplicadas nos poços. Em seguida, foi adicionado anticorpo secundário biotinilado. Durante a primeira incubação, o antígeno humano liga-se ao anticorpo imobilizado na placa, enquanto o anticorpo biotinado liga-se a um segundo sítio. Após a remoção do excesso do anticorpo secundário, a enzima estreptavidina-peroxidase (HRP-Linked Antibody) é adicionada. Depois da lavagem para remover o excesso de enzima livre, uma solução de substrato é adicionada (TMB), a qual se liga à enzima para produzir coloração azul. Após a adição de H₂SO₄ a coloração é convertida de azul para amarelo, e a leitura é feita no comprimento de onda a 450nm por um espectrofotômetro. A intensidade desse produto colorido é diretamente proporcional à concentração das citocinas inflamatórias IL-1α, IL-6, IL-8/CXCl8 e TNF-α humano presente no sobrenadante. Primeiramente, foi calculada a curva-padrão em um gráfico de absorbância em função da quantidade de citocina inflamatória secretada. Os valores de absorbância obtidos para os ensaios das amostras são plotados na equação de primeiro grau obtida a partir da curva-padrão para a determinação da concentração de cada citocina presente na amostra. Os ajustes de equação e determinação de parâmetros foram realizados utilizando o programa Microsoft Excel.

Análise estatística

Os ensaios foram expressos em média ± desvio padrão e a análise estatística foi realizada por teste t de Student obtidos com o auxílio do programa Microsoft Excel.

RESULTADOS

Teste de viabilidade celular

A substância teste foi preparada na concentração inicial de 200.000µg/ml, e as demais concentrações foram preparadas por diluições seriadas em fator de 1:10. Conforme apresentado no gráfico 1, as concentrações escolhidas para os ensaios subsequentes foram 1.000 e 100µg/ml. Nesse ensaio a substância de referência SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) foi utilizada a fim de garantir a efetividade tóxica da substância teste sobre a linhagem celular (Gráfico 2).

Liberação de citocinas inflamatórias por NHK

Quando os queratinócitos foram expostos ao LPS apresentaram aumento na liberação das citocinas IL-1α (2,8 vezes; p = 0,002), IL-6 (25,4 vezes; p = 0,001) e IL-8/CXCL8 (7,3 vezes; p = 0,0001), porém o LPS não induziu aumento significativo de TNF-α (p = 0,412).

A substância teste não apresentou redução significativa na liberação de IL-1α e IL-8 nas concentrações testadas, mas houve tendência de redução nos níveis de IL-1α e de IL-8 (Tabela 1). Por outro lado, foi observado aumento na liberação de IL-6 (105%) nas amostras tratadas com 1.000µg/ml da substância teste quando comparado ao controle LPS (Tabela 1; Gráfico 3). A liberação de TNF-α por queratinócitos está relacionada diretamente com a morte celular, e, como a concentração de LPS utilizada não induz morte, também não foi observado aumento de TNF-α. Contudo, a substância teste reduziu em 67,5% (p = 0,008) a liberação de TNF-α basal na maior concentração testada (1000µg/ml) quando comparado ao controle LPS (Tabela 1; Gráfico 3).

DISCUSSÃO

O envelhecimento está associado a níveis elevados de citocinas circulantes e marcadores pró-inflamatórios, como IL-6, IL-1 e TNF-α. Os metabolismos ósseo, nutricional e muscular são afetados pelo estado inflamatório que acompanha o envelhecimento, com suas alterações imunes, hormonais e adiposas, levando a um estado inflamatório crônico, no qual os níveis de citocinas pró-inflamatórias, principalmente TNF-α e IL-6, apresentam efeitos nocivos para a pele. Esse fenômeno, conhecido como imunossenescência, é acompanhado pelo aumento de citocinas pró-inflamatórias e redução de citocinas anti-inflamatórias, levando a inflamação crônica de baixo grau conhecida como inflammaging.^7-10 No processo de inflammaging ocorre aumento das reações inflamatórias em decorrência da idade, caracterizado por níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias IL-1, IL-6 e TNF-α.⁷ Como as interleucinas e as metaloproteínas estão relacionadas à inflamação e à resposta ao estresse oxidativo, seus genes são candidatos apropriados para o envelhecimento e doenças relacionadas com a idade e as infecções. A inflamação e a produção desregulada de citocinas inflamatórias têm papel importante nesse processo, que é caracterizado por níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, interleucinas e TNF-α, que têm demonstrado aumentar com a idade e estar envolvidos na patogênese da maioria das doenças associadas.^5,7,11 IL-6 é marcador de inflamação confiável, cujo nível circulante é aumentado com o tempo. O gene IL-6 é altamente polimórfico e expresso em linfócitos, fibroblastos e macrófagos em resposta a diferentes tipos de estímulos de inflamação. Além disso, IL-6 também controla a indução e expressão de metaloproteínas que mantêm a homeostase de zinco e cobre. Durante o estresse e a inflamação, a expressão gênica de metaloproteínas é induzida por citocinas pró-inflamatórias IL-1 e IL-6, que podem ser deletérias no processo de envelhecimento.^11-13 O sistema de resposta inflamatória não só oferece proteção contra a exposição a agentes inflamatórios e infecciosos, como também contribui na redução dos danos nos tecidos, melhorando a longevidade, que é caracterizada por equilíbrio entre agentes pró e anti-inflamatórios.^2,5,7

Diversos estudos in vitro e in vivo confirmam a atividade antioxidante da vitamina C e do Hibiscus. O extrato de hibisco apresenta potente efeito antioxidante, eliminando o oxigênio reativo e a atividade de radicais livres. Apresenta ainda ação protetora contra o dano oxidativo induzido por hidroperóxido de terci-butila (t-BHP), protege a célula da peroxidação lipídica e promove inibição da oxidação mediada por Cu² + LDL, além da formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBAR), inibição da formação de conteúdo de malondialdeído (100-300mg/kg), redução da depleção de glutationa e diminuição da atividade sanguínea de superóxido dismutase e catalase.¹⁴ A vitamina C apresenta conhecida ação antioxidante, além de exercer função fotoprotetora, sendo capaz de diminuir o eritema desencadeado pela irradiação UVB.¹⁵ Delphinol^® também possui capacidade antioxidante, reduzindo o estresse oxidativo intracelular. Além disso, elimina os estímulos pró-inflamatórios, aumenta a autofagia regulada pela sirtuína-1 e restaura a atividade do óxido nítrico sintase, com consequências sobre a vasodilatação, melhorando a microcirculação, normalizando a atividade plaquetária e contribuindo na atividade anti-inflamatória.¹⁶ Essa substância inibe a peroxidação lipídica, mediada por UVB, os danos oxidativos e ao DNA, protegendo assim a apoptose celular.¹⁷ Tal como acontece com todos os organismos complexos, sistemas biológicos únicos raramente trabalham isoladamente. Células neuronais dentro do eixo HPA contêm múltiplos receptores de citocinas, particularmente IL-1, IL-6 e TNF-α. Reduzir seus níveis circulantes controla o processo de inflamação.⁷ A suplementação oral com peptídeos de colágeno promove melhora das propriedades da pele. O colágeno aumenta a densidade de fibroblastos, regenera a matriz extracelular e estimula a síntese de ácido hialurônico, melhorando a hidratação e a flacidez da pele.^18,19

Com base nos resultados apresentados e considerando a composição da substância teste, podemos afirmar que o produto auxilia na redução do inflammaging e apresenta ação antioxidante, reduzindo a inflamação e retardando os mecanismos de envelhecimento da pele.

CONCLUSÃO

De acordo com as condições experimentais e metodologia utilizadas, a substância teste reduziu a liberação de TNF-α frente a um agente estressor, apresentou tendência na redução sobre a liberação de IL1-α e IL-8 e promoveu aumento da liberação de IL-6. Em virtude dos efeitos observados in vitro sobre a modulação de citocinas pró e anti-inflamatória, podemos concluir que a substância teste tem potencial efeito sobre o processo de inflammaging, e, consequentemente, sobre o envelhecimento.

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES:

Samanta Nunes | ORCID 0000-0001-5846-3372
Investigadora principal do estudo, autora principal do texto.

Andrea Costa Fruet | ORCID 0000-0002-2680-6665
Co-investigadora do estudo, contribuiu com a tabulação de dados e análise estatística.

Rodrigo Vieira Rodrigues | ORCID 0000-0002-7090-975X
Co-investigador do estudo, contribuiu com a tabulação de dados e análise estatística.

Juliana Cotta Vieira | ORCID 0000-0002-6103-690X
Co-investigadora do estudo, contribuiu com a revisão do artigo.

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