Avaliação bioquímica e toxicológica de uma água mineral brasileira e seus efeitos cutâneos em uso tópico

Data de recebimento: 10/05/2011
Data de aprovação: 30/08/2011

Trabalho realizado no Instituto de
Bioengenharia da Pele - EVIC Brasil Ltda e
Tridskin Laboratórios Ltda.

Suporte financeiro: Trabalho recebeu material
do laboratório PuraInova para análise.
Conflito de interesse: Material fornecido pelo
laboratório PuraInova para realização do
estudo.

Abstract

Introdução: A indústria de cosméticos francesa comercializa águas minerais como tendo benefícios biológicos.
Objetivo: O presente estudo analisa, in vitro e in vivo, a composição oligomineral, assim como as características físico-químicas e efeitos biológicos de uma água mineral brasileira.
Métodos: Foram conduzidos testes para avaliar as propriedades químicas, a citotoxidade (células viáveis) e a irritabilidade (teste het-cam). Estudos in vitro foram realizados para avaliar a capacidade de indução de expressão gênica e de detecção imunohistogênica de filagrina e aquaporina 3, de atividade de nf-kb e de proliferação de fibroblastos, em rela- ção à água Milli Q.
Resultados: A água estudada apresentou um alto índice de estrôncio (0,61 mg/ml). A expressão da filagrina e respectivos testes munohistoquímicos foram relevantes. A aqua- porina 3 aumentou 1,8 vezes e a atividade do nf-kb decresceu 47%. A água em questão também foi capaz de estimular a proliferação de fibroblastos.
Conclusão: A avaliação dessa água mineral originária da Serra do Japi (SP, Brasil), indi- ca a existência de potencial para figurar como tratamento adjuvante em dermatologia, pois os resultados sugerem que ha hidratação da barreira cutânea, estimulo`a proliferação de fibroblastos, além da reparação e inibição de reações inflamatórias. Estudos clínicos adicionais devem ser realizados para que tais resultados sejam confirmados.

Keywords: ÁGUAS MINERAIS, BRASIL, COSMÉTICOS

INTRODUÇÃO

Muitos estudos publicados na literatura demonstraram que as fontes possuem águas minerais ou termais com diferen- tes características físico-químicas e que essas diferenças podem ter influência na aplicação clínica na dermatologia. Sendo o Brasil rico em bacias hidrográficas e fontes de águas minerais, a análise de águas minerais brasileiras é oportunidade de aprovei- tar e valorizar os recursos naturais a fim de utilizá-los de forma comprovada em afecções dermatológicas. O presente estudo visa descrever uma água mineral brasileira, suas características e efei- tos biológicos, bem como estudos clínicos realizados na pele. A água mineral a ser descrita é originária das águas pluviais infil- tradas no subsolo da fonte Alvorada, localizada na Mineração Joana Leite Ltda, na Serra do Japi, em Jundiaí. A Serra do Japi é marco geológico, com centenas de quilômetros quadrados e com cobertura de florestas atlânticas de planalto, representando um dos maiores refúgios de biodiversidade florística e faunística do Estado de São Paulo. Suas rochas, extremamente duras, figu- ram entre as mais antigas da região (datam de mais de 570 milhões de anos) e, com seus mais de 1.200 metros de altitude, foram cobertas por geleiras. O clima da região é tropical, com temperaturas médias anuais variando entre 18 e 20°C, com volume anual de precipitações na ordem de 1.300ml.

OBJETIVOS

Estudar a composição e as características biológicas da água mineral da Serra do Japi, proveniente da fonte Alvorada, localizada em território de mata atlântica no Estado de São Paulo, Região Sudeste do Brasil. Das características físico-quí- micas e biológicas, pretendeu-se avaliar a segurança e a eficácia in vitro, bem como verificar os efeitos biológicos a confirmar cli- nicamente.

MÉTODOS

Características físico-químicas, citotoxicidade e irritabilidade ocular
Foram avaliadas as características físico-químicas, citotoxi- cidade (células viáveis) e irritabilidade ocular (HET-CAM) da água mineral da fonte Alvorada. O teste de citotoxicidade foi rea- lizado em cultura de células (fibroblastos Balb/C 3T3, clone A31). O método baseou-se na redução do crescimento celular e contagem de células viáveis, o que indica a citotoxicidade. O teste de irritabilidade (HET-CAM) foi realizado com um con- trole positivo (solução de SDS a 1%), um controle negativo (solu- ção salina) e uma amostra de água sem minerais (Água Milli Q).

Estimulação da expressão gênica de filagrina e aquaporina 3
Foram ainda realizados estudos para avaliar a expressão gênica de filagrina e de aquaporina 3 pelo teste chamado Real Time PCR. Queratinócitos humanos (Cascade Biologics, EUA) foram cultivados, e, após seis horas de contato com a água mine- ral, o RNA total foi extraído utilizando-se Trireagent® Solution (Applied Biosystems) e quantificado através da utilização de Quant-iTTM RNA Assay Kit (Invitrogen) realizando-se a leitu- ra no equipamento Quibit® Fluorometer (Invitrogen). Os testes foram conduzidos em um aparelho StepOnePlus (Applied Byosystems). Para a realização dos ensaios de expressão gênica de filagrina, foi utilizado um sistema de ensaio TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Byosystems); para análise da expres- são gênica de aquaporina 3, o kit EXPRESS One-Step SYBR® GreenERTM (Invitrogen). Em ambos os estudos, a quantidade relativa de mRNA foi calculada conforme descrito por Pfaffl 1 e Gregory & Edith. 2 Para avaliar a estimulação da expressão gêni- ca de filagrina, foi realizada, ainda, análise imuno-histoquímica em microscópio de fluorescência (Leica – DM 1000) de frag- mentos de pele ex-vivo, coletados após a cirurgia plástica. Os anticorpos utilizados para essa análise foram: anticorpo primário antifilagrina (Santa Cruz; sc-AKH1) e anticorpo secundário Alexa Flour 488-Goat anti Mouse (Invitrogen; A11001).

Diminuição da atividade do fator de transcrição nuclear (NF-¿ß)
A atividade do NF-kß foi avaliada por meio de cultura de queratinócitos humanos. As células foram submetidas à radia- ção UVA/UVB e mantidas novamente em contato com o pro- duto por mais 24 horas. A atividade do NF-kß foi mensurada utilizando kit da empresa Cayman Chemical, EUA.

Estimulação da proliferação de fibroblastos
Para avaliar o estímulo do crescimento celular, foi feita fixação e lise, com leitura de absorbância a 260nm. Utilizou-se o plaqueamento em meio DMEM diluído em água desminera- lizada (Milli-Q - controle) e outra placa em meio diluído em água mineral da fonte Alvorada.

RESULTADOS

Características físico-químicas
A água mineral da fonte Alvorada é água natural caracte- rizada pela presença de 15 macro e microminerais. A água mine- ral da Serra do Japi nasce à temperatura de 21°C, com pH de 5,9, sem nenhuma contaminação microbiológica, em fonte localizada a 970 metros do nível do mar. As características físico- químicas e composição dessa água são apresentadas na tabela 1.

Citotoxicidade e irritabilidade ocular (HET-CAM)
A água mineral da fonte Alvorada não apresentou ativi- dade citotóxica nem potencial irritante no teste HET-CAM.

Estimulação da expressão gênica de filagrina
A incubação da água mineral da fonte Alvorada, em cul- tura de queratinócitos humanos, foi capaz de aumentar de maneira relevante a expressão relativa de filagrina (mRNA) nas concentrações 12,5 e 6,25% (v/v) (1,75 e 2,87 vezes, respecti- vamente), conforme pode ser verificado no gráfico 1. Os resul- tados demonstram aumento de 1,5 vez a expressão gênica de filagrina (m-RNA) em comparação com o grupo-controle.

A maior produção de filagrina também foi evidenciada pela técnica de imuno-histoquímica (Figura 1). Os cortes foram incubados com anticorpos antifilagrina (em verde) e marcador de DNA (em azul). As análises foram feitas em microscópio de fluorescência.

Estimulação da expressão gênica de aquaporina 3
Os resultados do gráfico 2 demonstram que a água mine- ral da fonte Alvorada foi capaz de aumentar de maneira relevan- te a expressão relativa de aquaporina 3 nas concentrações 25 e 12,5% em 1,8 e 1,7 vez, respectivamente.

Diminuição da atividade do fator de transcrição nuclear (NF-¿ß)
Testes científicos com queratinócitos cultivados in vitro evidenciaram que a água mineral da fonte Alvorada diminuiu a quantidade de NF-¿ß produzido por essas células, especialmen- te após a exposição solar (Gráfico 3).

Estimulação da proliferação de fibroblastos
Com base nos resultados obtidos, verificou-se que a água mineral da fonte Alvorada teve a capacidade de estimular o cres- cimento de fibroblastos, com diferença estatisticamente significa- tiva da água Milli Q, usualmente utilizada para o crescimento em culturas de células. Os resultados encontrados estão no gráfico 4.

DISCUSSÃO

As características físico-químicas observadas mostram que a água da fonte Alvorada pode ser classificada como água mineral, mas não termal, visto que ela sai da fonte à temperatu- ra de 21ºC, ou seja, quase em temperatura ambiente. A defini- ção de água termal envolve água mineral que sai de sua fonte a pelo menos 4ºC acima da temperatura ambiente. Com relação ao pH, verificou-se o valor de 5,9, bem próximo ao pH da pele, o que sugere melhor compatibilidade fisiológica nas afecções cutâneas. O baixo conteúdo de resíduo seco, de 42,27mg/L (água leve, ou seja, com menor concentração de sais minerais), sugere boa aceitabilidade em afecções com comprometimento de barreira cutânea. Com relação à composição química, vale destacar a alta concentração de estrôncio e cálcio, cujos testes in vitro demonstram ação anti-inflamatória. Há indícios, por meio de testes in vitro, de que os demais minerais presentes na água mineral da fonte Alvorada sejam adequados ao uso em afecções dermatológicas inflamatórias.

Os testes de citotoxicidade e irritabilidade (HET-CAM) demonstraram a segurança in vitro cutânea e ocular da água mineral da fonte Alvorada.

Os testes de expressão gênica de filagrina e sua análise imuno-histoquímica objetivaram analisar a ação dessa água mineral na recuperação da barreira cutânea. A integridade da barreira cutânea e a manutenção do equilíbrio hídrico da pele não podem ser consideradas unicamente pela presença de subs- tâncias específicas, mas sim pela complexidade do equilíbrio entre os elementos de sua composição global. 3 Parte desse com- plexo equilíbrio é gerido pelo envelope corneificado epidérmi- co (ECE), uma camada lipoproteica que substitui a membrana plasmática dos corneócitos e consiste de complexa mistura de proteínas interligadas covalentemente associada a uma camada de característica lipídica anexada à superfície extracelular da camada proteica. 4 Muitos constituintes do ECE têm sido iden- tificados, entre eles, pró-filagrina, filagrina, involucrina, loricri- na, diversos subtipos de queratina. 5 A proteína epidérmica pró- filagrina, sintetizada de forma tardia durante a diferenciação epi- dérmica, desempenha papel crucial na geração e manutenção da flexibilidade e hidratação do estrato córneo (EC). 4,6 Durante a transição da camada granular para o EC, a pró-filagrina (alta- mente fosforilada) é convertida em filagrina por proteólise espe- cífica e defosforilação. 5 Os monômeros resultantes da filagrina associam-se aos filamentos intermediários de queratina e são os verdadeiros responsáveis por sua coesão. 7,8 No EC a filagrina - proteína catiônica que auxilia na agregação e subsequentes liga- ções dissulfeto entre filamentos de queratina - é liberada das interações com queratina e totalmente degradada em seus cons- tituintes aminoácidos, tais como PCA e ácido urocânico. 4,8,9 Esses aminoácidos constituem aproximadamente 50% dos NMFs e são retidos no interior dos corneócitos maduros no EC. Os NMFs são cruciais na manutenção da hidratação da barreira epi- dérmica e encontram-se reduzidos na pele seca ou ressecada, efeito que é mais pronunciado com o envelhecimento e frente às alterações sazonais. Em condições nas quais a pró-filagrina se encontra diminuída (como na dermatite atópica) ou ausente (como na ictiose vulgar), a qualidade do EC fica comprometida devido à deficiência de NMF e consequente perda de água tran- sepidérmica. 10,11 O aumento da filagrina determinado por esses testes pode ter importância clínica no tratamento coadjuvante de muitas afecções dermatológicas.

Outro teste que denota o aumento da hidratação cutânea pode ser avaliado por meio da expressão gênica de aquaporina 3. As aquaporinas são canais presentes nas membranas plasmáti- cas das células responsáveis pelo transporte de água e de peque- nas moléculas de soluto, especialmente glicerol, essenciais para a manutenção do equilíbrio hidroeletrolítico celular de todos os organismos vivos. São amplamente distribuídas nas membranas celulares e fazem parte de uma classe maior de proteínas deno- minadas proteínas integrais ("MPIS – major intrinsic protein"). Das várias aquaporinas, a AQP3, que se localiza na epiderme, possui maior intensidade nas membranas plasmáticas das células basais e das células intermediárias adjacentes. 12 Como as células da epi- derme sofrem constante diferenciação, a presença de AQP3 diminui gradativamente até seu completo desaparecimento na camada queratinizada da pele, denominada estrato córneo. A AQP3 também está presente em estruturas associadas à epider- me como nos folículos e nas glândulas capilares e atuam como maquinaria especializada capaz de suprir a perda excessiva de água. 13 Outros estudos revelam a capacidade transportadora de água dos canais de aquaporina. A permeabilidade à água nas células da epiderme é inibida por agentes mercuriais e por pH ácido, indicando que realmente o transporte de água é carreado pela presença desses canais. 14 Nesse sentido, mostrou-se que a redução da permeabilidade à água é acompanhada também por mudanças na permeabilidade ao glicerol, de modo que as AQP3 possuem importante papel na hidratação da epiderme. 15 Queratinócitos, melanócitos, fibroblastos, células endoteliais e adipócitos estão igualmente envolvidos em dinâmica interação capaz de detectar uma variedade de perturbações no ambiente cutâneo e rapidamente transmitir sinais apropriados que alertam e recrutam componentes do sistema imunológico. 16,17 Uma vez estimuladas, essas células são capazes de ativar e liberar vários fatores que promovem a expressão de inúmeros receptores que estão significativamente envolvidos na imunorregulação e bios- síntese de eicosanoides. 18,19

Já o fator de transcrição nuclear kappa B (NF-¿ß) foi analisado devido a sua importância em muitas doenças derma- tológicas. Sabe-se que ele desempenha papel crucial no proces- so de ativação de genes que codificam a síntese de citocinas pró- inflamatórias, moléculas de adesão, quimiocinas, eicosanoides e óxido nítrico, dando início a uma série de manifestações fisio- lógicas que culminam na degradação tecidual. 20,21 Cabe ressaltar que NF-¿ß é um dos principais fatores de transcrição envolvi- dos nos sinais e sintomas observados na pele após exposição aguda à RUV. 20 Nesse sentido, produtos contendo substâncias ativas com propriedades anti-inflamatórias e calmantes podem prevenir o dano tecidual e atenuar os aspectos envolvidos no estresse pós-fotoexposição, bem como os sinais característicos no fotoenvelhecimento. O NF-¿ß é complexo proteico que regula a resposta imunológica e está envolvido em respostas celulares a estímulos como estresse e radiação ultravioleta.

O último teste in vitro realizado analisou a proliferação de fibroblastos induzida pela água mineral em estudo. Sabemos que as células se reproduzem pela duplicação de seus conteúdos e, então, dividem-se em duas. Esse ciclo de divisão celular é a maneira fundamental pela qual todos os seres vivos são reprodu- zidos. Em espécies multicelulares, diversos ciclos de divisão celu- lar são requeridos, e a divisão celular é necessária para substituir as células que são danificadas, funcionalmente deficientes ou que são perdidas por morte celular programada (apoptose). Assim, um adulto humano precisa manufaturar milhões de novas célu- las a cada segundo simplesmente para manter o estado de equi- líbrio, e se a divisão celular é danificada, por exemplo, por uma dose de radiação ionizante, o indivíduo morrerá em poucos dias. 22 O índice de crescimento celular mostra quanto tempo a célula leva para se duplicar ou o período de duplicação celular. A proliferação de fibroblastos observada nesse teste pode ter ocorrido devido à presença de íons necessários para o cresci- mento celular como, por exemplo, o cálcio.

Todos os testes in vitro parecem corroborar a hipótese de que a água mineral da Serra do Japi apresente efeitos biológicos na pele devido a suas características físico-químicas. Uma das substâncias de sua composição, que difere da de outras águas dis- poníveis comercialmente, é a presença de estrôncio. Hahn23 demonstrou que sais de estrôncio podem ser usados antes de algum tratamento ou mesmo em associação com a substância irritante com o objetivo de inibir a irritação sensorial e a der- matite irritativa. Em outro estudo de Zhai e colaboradores, foi testada a associação de nitrato de estrôncio a 20% e ácido glicó- lico a 70%, também demonstrando que o estrôncio poderia suprimir a sensação de irritação quimicamente induzida. 24 Em resumo, há indícios de propriedades hidratantes, com ação de reconstituição de barreira cutânea, assim como efeito anti-infla- matório por meio da redução da atividade de NF-kb. O papel do estrôncio também sugere que essa composição possa reduzir a irritação da pele. Vale ressaltar que este último está envolvido na fisiopatogenia de muitas doenças dermatológicas. Todos os efeitos aqui comprovados in vitro ainda devem ser confirmados e testados clinicamente por meio de ensaios controlados.

CONCLUSÃO

O presente estudo pode ser considerado avaliação inicial da água mineral da fonte Alvorada que se mostrou promissora ao sugerir efeitos biológicos de redução de inflamação, de recons- trução de barreira cutânea e de hidratação. A eficácia dos efeitos in vitro deve ser comprovada posteriormente por meio de ensaios clínicos. Ademais, considerando que o Brasil é um dos países mais ricos em fontes de águas minerais, vislumbram-se grandes oportunidades de pesquisas relacionadas com os dife- rentes efeitos biológicos que possam ser observados com as mais diversas águas minerais brasileiras. Conhecer todas as caracterís- ticas físico-químicas e biológicas dessa água mineral brasileira é de suma importância no entendimento de sua aplicabilidade clí- nica e dermatológica.

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