Keywords: COLÁGENO, FOTOENVELHECIMENTO, ENVELHECIMENTO DA PELE
O envelhecimento cutâneo é um processo degenerativo, insidioso, complexo e multifatorial (com relevância em relação à irradiação UV) que inevitavelmente atinge todos os seres humanos.1 A grande exposição da pele às agressões externas, associada a fatores genéticos, endócrino-metabólicos, imunológicos e outros elementos intrínsecos, faz com que a suscetibilidade do tecido cutâneo aos eventos relacionados ao envelhecimento seja mais característica e visualmente mais proeminente.2
O envelhecimento cutâneo ocorre devido a dois processos concomitantes: envelhecimento intrínseco ou cronológico, quando acomete áreas protegidas do sol, e fotoenvelhecimento ou extrínseco, quando acomete áreas expostas ao sol.3,4
O envelhecimento cutâneo intrínseco é determinado por fatores genéticos e agravado por fatores neuro-hormonais, portanto independente dos fatores externos ou ambientais.1,4,5 Ele reflete o mesmo mecanismo degenerativo visto em outros órgãos, no entanto, a pele é um dos parâmetros mais influenciados pela idade.1,5 As mudanças hormonais ocorridas durante o envelhecimento irão ocorrer diretamente relacionadas com o fenótipo da pele (fototipo).5 Em áreas protegidas do sol, como ocorre no envelhecimento intrínseco, a pele fica mais fina, há o aparecimento de rugas delicadas, aspereza, perda de elasticidade e gordura subcutânea, contudo é um envelhecimento mais suave que o do foto envelhecimento.1 Quando o envelhecimento é intrínseco, observamos redução no número e função dos fibroblastos e destruição de importantes estruturas - especialmente colágeno, elastina e fibronectina -, e ocorre também alteração na homeostase celular proliferativa , resultando em lesões muitas vezes malignas ou irreversíveis.6,7
As fibras colagênicas conferem à derme sua integridade estrutural e mecânica e a elastina desempenha importante propriedade elástica da pele.8 A fibronectina é capaz de contrair e organizar o tecido conectivo, promover adesão celular em eventual processo de cicatrização, reepitelização e é ainda a principal responsável pela integridade da junção dermoepidérmica.9-11 Com o envelhecimento, há significativa redução na quantidade e na qualidade da fibronectina, observada na JDE, o que se configura em um dos principais marcadores dermoepidérmicos de envelhecimento.10,12 Já foi demonstrado (Rocquet et al. 2002) que a quantidade de fibronectina encontra-se diminuída nas rugas e que sua degradação enzimática é aumentada significativamente com a idade.11
A habilidade de nosso sistema imunológico reduz-se drasticamente com o avançar da idade, o que é considerado uma das maiores causas do aspecto de envelhecimento cutâneo e de suscetibilidade às infecções e ao câncer.13 O motivo dessa redução ainda é obscuro, mas sabe-se da importância da diminuição do número de células de Langerhans da pele, defeito das células T de memória, diminuição da resposta proliferativa de linfócitos e redução da capacidade do organismo de produzir anticorpos.13,14 No envelhecimento há alteração do padrão do sistema imunológico da pele, que de resposta T h1, se altera para o padrão dominante Th2. A resposta Th1 (T helper 1), com IL1 (interleucina 1), IL8, TNF (fator de necrose tumoral alfa) e INF (Interferon gama), moléculas de adesão, quimiocinas, eicosanoides e óxido nítrico, dá início às manifestações fisiológicas que culminam em degradação tecidual, já que esse padrão é de produção de citocinas pró-inflamatórias. O padrão imunológico Th2 é acompanhado pelo aumento de IL4, IL5 e IL10, esta última com a função de conter a resposta inflamatória, favorecendo muito a aceleração do envelhecimento intrínseco.13,14
O envelhecimento extrínseco, ou fotoenvelhecimento, é caracterizado pela soma da contínua exposição às variações ambientais, como radiação solar, térmica, energia mecânica, alterações de umidade e/ou insultos químicos ou biológicos.2 Esse envelhecimento é decorrente da irradiação UV que danifica principalmente as estruturas morfológicas dérmicas da pele, afetando sua consistência, resiliência e propiciando o foto envelhecimento precoce.4,15 É processo cumulativo que ocorre com base no grau de exposição ao sol e no fototipo do paciente.5
As irradiações UV e infravermelha (IV) causam alterações nos componentes celulares e ativam as metaloproteinases da matriz (MMPs), que alteram a matriz extracelular (MEC) do colágeno, degradando, assim, sua integridade e consequentemente causando alterações principalmente na derme.15,16 A irradiação UV ataca também estruturas epidérmicas, queratinócitos e fibroblastos, resultando na ativação de receptores de superfície que transmitem sinal capaz de causar mudanças moleculares, que levam à destruição de colágeno extracelular e parada da sintetização de novo colágeno, como também acúmulo de elastina desorganizada e seu componente, a fibrina, na derme profunda, assim como importante perda de colágeno intersticial.17
Essa irradiação também leva à formação de agentes patogênicos que produzem radicais livres (reactive oxygen species - ROS), os quais têm papel crucial de degradação e dano dos sistemas antioxidantes não enzimático e enzimático de defesa da pele.3,4,17 Eles danificam estruturas nobres da pele, tais como membranas celulares, segmentos de DNA e fibras colágenas e elásticas, que causam envelhecimento cutâneo.1,3,6,17 Conse - quentemente a pele exposta à irradiação UV tem aparência mais grosseira, seca, com rugas profundas e bem demarcadas e com pigmentação mosqueada.15
A irradiação infravermelha, assim como a UV, está envolvida no fotoenvelhecimento e no fotodano (carcinogênese).16
Diante dessas circunstâncias o intuito desta pesquisa foi conhecer a possível contribuição desse produto cosmecêutico à base de fitoestrógenos na atenuação e prevenção das manifestações estéticas decorrentes do envelhecimento, observado juntamente com as suas alterações histológicas dermoepidérmicas.
O presente estudo foi realizado nas formas in vitro e in vivo, todas devidamente aprovadas por comitês universitários de éticas em pesquisa.
A etapa in vitro foi realizada em três modalidades de análise. Os estudos foram compostos pela utilização de células humanas em ótimas condições de cultivo, realizada de acordo com as metodologias atuais aplicadas, aceitas e validadas pela comunidade científica internacional.
A primeira das modalidades in vitro foi realizada a fim de se observar como o produto à base de fitoestrógeno se mostrou em relação à expressão gênica de fibronectina e pró-colágeno tipo I. Realizaram-se culturas de queratinócitos (Cascade Biologics, Inc. – Portland/OR, EUA) e fibroblastos humanos (Lonza Walkersville, Walkersville, EUA) em meios de cultura específicos; ambos foram semeados em garrafas de 75cm2, cultivados e expandidos em estufa úmida a 37°C em presença de 5% de CO2. A incubação para queratinócitos e fibronectina foi de seis horas e, de 12 horas, para fibroblastos e pró-colágenos. A viabilidade celular foi determinada pela técnica de MMT ((3-(4,5- dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina). Para avaliar a expressão gênica de fibronectina e pró-colageno foram utilizados PCR (polymerase chain reaction) de tempo real, e o resultado foi calculado a partir da quantidade de mRNA.
A segunda modalidade foi avaliação da atividade imunomoduladora (síntese de citocinas pró e anti-inflamatórias) do ativo cosmético. A análise foi feita a partir do isolamento do fitoestrógeno, que é um extrato estabilizado de três algas marinhas vermelhas e marrons, e assim foram analisados seus efeitos na produção da citocina pró-inflamatória (Th1) IL-1 e antiinflamatória (Th2) IL- 10 em cultura de queratinócitos humanos. Esses queratinócitos foram semeados, cultivados e expandidos em estufa úmida a 37ºC. As culturas foram incubadas com seis concentrações não citotóxicas do produto, determinadas previamente pela técnica de MMT. As células foram mantidas em contato com o produto teste e lipopolisacarídeo (LPS; serve para estimular cronicamente as células, a fim de simular o envelhecimento cronológico ou microinflamatório, para assim avaliar a possível atividade imunomoduladora in vitro do produto teste) durante três dias consecutivos, para posterior coleta do sobrenadante. As citocinas foram quantificadas utilizando kits de ensaio imunoenzimáticos (Elisa) e o anticorpo monoclonal anticitocina de captura foi adicionado na placa.
A terceira modalidade consistiu da análise histoquímica e por imunofluorescência da pele e da JDE (junção dermoepidérmica) com o produto em questão. Foi feita avaliação das características gerais da pele, como condição do estrato córneo, da epiderme viável, do número de microvilosidades, bem como a marcação de fibronectina. A análise foi feita por imunofluorescência a partir da incubação com o produto em fragmentos de pele ex-vivo incubados com o anticorpo primário antifibronectina e posteriormente Alexa Flour. A análise histoquímica foi feita com coloração de hematoxilina-eosina (HE), e também foram analisados cortes para histoquímica corados pela técnica de Sirius Red, para visualização de fibras colagênicas.
A etapa in vivo foi realizada de forma clínica, aberta, monocêntrica, fase IV, de modo prospectivo, comparativo, envolvendo 76 voluntárias randomizadas e divididas em dois grupos de 38, com idade entre 45 e 70 anos e fototipo de I a III. O estudo teve duração de 120 dias. As voluntárias foram incluídas no estudo após terem lido, concordado e assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), que foi então conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki, Boas Prática Clínicas e as diretrizes da International Conference of Harmonization (ICH).
As voluntárias foram submetidas a wash-out com uso exclusivo de fotoprotetor FPS 15 (Episol® FPS 15, Mantecorp Indústria Química e Farmacêutica Ltda., Rio de Janeiro/RJ, Brasil) durante 30 dias, utilizado duas vezes ao dia (manhã e hora do almoço). Após o uso exclusivo do fotoprotetor, iniciou-se a dispensa dos produtos de acordo com cada Grupo: A) utilizou o produto antienvelhecimento à base de fitoestrógenos e FPS 20 (Age Care FPS 20 e PPD 10, Mantecorp Indústria Química e Farmacêutica Ltda., Rio de Janeiro/RJ, Brasil) pela manhã e na hora do almoço; B) utilizou os mesmos produtos do Grupo A, nos mesmos regimes posológicos, associados a outro produto cosmecêutico antienvelhecimento de mercado (Epidrat Lift, Mantecorp Indústria Química e Farmacêutica Ltda., Rio de Janeiro/RJ, Brasil), utilizado à noite. As voluntárias fizeram uso dos produtos que lhes foram indicados durante 90 dias consecutivos.
Para triagem, foi analisado se as voluntárias possuíam todos os critérios de inclusão (idade entre 45 e 70 anos; menopausadas; pele fototipo I a III, segundo a classificação de Fitzpatrick; estar livre de doenças que, a critério do investigador, pudessem interferir na avaliação do envelhecimento cutâneo; capacitadas e habilitadas a seguir e aderir ao esquema de visitas e ao tratamento instituído; não possuir histórico sabido de reação alérgica aos componentes do produto investigacional; estar em uso exclusivo de fotoprotetor facial FPS 15 até, no mínimo, 30 dias anteriores ao início do estudo) e nenhum critério de exclusão (não estar em uso de medicamentos/cosméticos/tratamentos que, segundo o investigador, pudessem interferir na avaliação da resposta do estudo; qualquer outra razão que, a critério do investigador, oferecesse risco ao voluntário ou interferisse nos objetivos do estudo; exposição ao sol de forma intensa até 60 dias antes da triagem; presença de lesões cutâneas na área a ser avaliada; abuso de drogas ilícitas; tabagismo; portadores de endocrinopatias, principalmente gonadais e/ou suprarrenais e/ou tireoide).
A cada 30 dias de estudo, eram avaliados os critérios de exclusão, bem como era verificada a adesão da voluntária (deixar de utilizar qualquer um dos produtos por cinco dias seguidos ou dez dias intercalados, durante todo o estudo), além de submetê-las à realização de ultrassom cutâneo de 20MHz (SkinScanner USB-DUB6100, TPM-Taberna Pro Medicum GmbH, Lüneburg, Alemanha), avaliados eventos adversos e realizada análise fotográfica (Canon™ Power Shot G10, Japan). Além disso, eram avaliadas a tolerabilidade subjetiva quanto ao produto e análise subjetiva da resposta terapêutica tanto por parte do investigador quanto das voluntárias.
A avaliação subjetiva da eficácia foi feita utilizando uma escala para classificar a resposta, que poderia ser: +4: melhora completa; +3: melhora acentuada; +2: melhora moderada; +1: melhora discreta; zero: manutenção; -1: piora discreta; -2: piora moderada; -3: piora acentuada; -4: piora completa. Para avaliação subjetiva da tolerabilidade foram utilizados os critérios: excelente, para ausência total de eventos adversos; boa, para eventos facilmente tolerados; regular, para eventos que podem ser tolerados e que não levam à descontinuação do tratamento; ruim, para eventos cujos efeitos obrigam à interrupção do tratamento.
A ultrassonografia foi utilizada para avaliar a densidade dérmica, e sua análise foi subjetiva e comparativa com a imagem da ultrassonografia anterior, cujo padrão de resposta foi: aumentou muito; aumentou; inalterado; diminuiu e diminuiu muito. Além disso, realizou-se biópsia cutânea com punch n. 2 na face (na região pré-auricular) a fim de avaliar o padrão das fibras colágenas (tricrômio de Masson) e elásticas (Verhoeff).
A fim de avaliar os resultados obtidos através da aplicação de questionários para o médico e voluntário, bem como avaliar os resultados de ultrassom e biópsia cutânea, foi realizado o teste estatístico de igualdade de duas proporções. Esse teste compara se a proporção de respostas de duas determinadas variáveis e/ou seus níveis é estatisticamente significante. Em todo o estudo, os resultados considerados estatisticamente significativos foram aqueles com valores de "p" inferiores a 0,05.
Na etapa in vitro da atividade imunomoduladora, a técnica estatística utilizada foi a análise de variância (ANOVA). O teste de Tukey foi utilizado quando a análise de variância detectava diferenças significativas entre os grupos. Em todos os grupos estudados, foram considerados estatisticamente significativos aqueles com valores de "p" inferiores a 0,05. Para as etapas de expressão gênica de fibronectina e pró-colágeno, foi considerada relevante (ou significativa) quando valores obtidos na expressão foram uma vez e meia superiores ao do controle. Para inibição da expressão, foram considerados relevantes valores meia vez inferiores ao do controle.
Os resultados obtidos na análise in vitro demonstraram mudanças significativas na avaliação do produto em questão.
Em relação à etapa que avaliou a expressão gênica de fibronectina e pró-colágeno tipo I, os valores considerados como aumento relevante foram aqueles uma vez e meia superiores ao do controle. Para inibição da expressão, foram considerados relevantes valores meia vez inferiores ao do controle. A incubação do complexo de fitoestrógenos em culturas de queratinócitos humanos teve a capacidade de produzir importante aumento na expressão relativa de fibronectina (na forma de mRNA) nas concentrações de 0,1; 0,05; 0,025 e 0,012% (Gráfico 1). Em relação à expressão relativa do pró-colágeno tipo I (na forma também de mRNA), o complexo de fitoestrógenos foi capaz de aumentar de maneira significativa sua expressão relativa nas concentrações 0,2; 0,1 e 0,05% (Gráfico 2).
Em relação a avaliação da atividade imunomoduladora, vêse que, de fato, a incubação crônica das células com LPS simula o envelhecimento cronológico, gerando alteração na resposta imunológica, através de aumento de IL-10 (+ 3,68 vezes) e discreta redução de IL-1 (-1,8 vez). Porém, quando se adicionou o complexo de fitoestrógenos às culturas de células incubadas cronicamente com LPS, o perfil de resposta foi modificado, fazendo com que os níveis basais da citocina pró-inflamatória IL-1 aumentassem e retornassem àqueles do controle. O complexo foi capaz de causar redução dos níveis de IL-10 nas concentrações de 1,6%; 0,8%; 0,4% e 0,2%, em aproximadamente três vezes quando comparado ao grupo-controle, que só recebeu LPS (Gráficos 3 e 4).
Pela análise de imunofluorescência, houve nítido aumento da intensidade fluorescente do sinal antifibronectina na JDE (Figura 1).
Pela técnica de HE, verificou-se melhora nas condições gerais dos fragmentos tratados com o complexo de fitoestrógeno (Figura 2). A comparação com o controle evidenciou aumento da viabilidade e espessura da epiderme, maior coesão e compactação do estrato córneo e aumento das microvilosidades na JDE. A visualização das fibras colagênicas pela coloração de Sirius Red evidenciou mais intensidade e homogeneidade da coloração vermelha (fibras de colágeno) em comparação ao controle (Figura 3).
Após o término da etapa in vitro, partiu-se para a etapa in vivo. Das 76 voluntárias incluídas, 72 concluíram o estudo; as quatro que desisitiram, o fizeram por motivos pessoais, sem relação com os produtos-teste.
Através da avaliação subjetiva de eficácia das voluntárias, observou-se bom desempenho tanto do grupo A quanto do B em melhorar principalmente rugas, linhas finas, melanoses solares, outras hipercromias, hidratação, viço, suavidade ao toque e aparência geral. A análise comparativa dos grupos não apontou muitas diferenças entre eles, com exceção ao eritema, que, no grupo B, apresentou aumento da resposta "melhora moderada", e o grupo A obteve maior porcentagem da resposta "manutenção" (Tabela 1).
Através da avaliação médica subjetiva de eficácia, observou-se, em geral, bom desempenho tanto do grupo A, quanto do B. A análise comparativa dos grupos não apontou muitas diferenças entre os mesmos. Apenas para linhas finas eritema, na visita D90, o grupo B apresentou melhor desempenho do que o grupo A (Tabela 2).
Os grupos apresentaram boa tolerabilidade cutânea conforme está ilustrado, não apresentando diferenças estatísticas tanto na avaliação visita a visita de cada grupo, quanto na avaliação comparativa entre eles. Observou-se, sim, prevalência da resposta "ausência" de eventos adversos para todos os parâmetros da avaliação subjetiva de tolerabilidade (eritema, ressecamento e descamação) (Tabela 3). A respeito da avaliação de segurança dos produtos, entre os eventos adversos a eles relacionados, não foi encontrada diferença estatística entre as visitas para os dois grupos. No grupo A, eles não ocorreram; no B, na visita D60, observou- se apenas um episódio de eritema na região malar, na asa nasal, com provável relação causal com o uso dos produtos, o qual foi resolvido totalmente e de forma espontânea antes do D90, sem suspensão do uso nem exclusão da voluntária do estudo clínico. Em relação aos eventos adversos não relacionados ao uso dos produtos, todos foram resolvidos em ambos os grupos.
Quanto ao ultrassom, viu-se que ambos os braços do estudo mostraram resposta favorável no tocante à redensificação dérmica (tanto para o grupo A, quanto para o grupo B, em D30, houve prevalência das respostas "aumentou muito" e "aumentou" fazendo alusão à quantidade de colágeno em D0). Comparando-se os grupos, viu-se que, na visita D60, no grupo A, houve queda da resposta "aumentou muito", mantendo as outras respostas em relação a D0, e, em D90, houve queda da resposta "aumentou" e aumento das respostas "diminuiu" e "diminuiu muito", em relação a D60; para o grupo B, em D60, houve prevalência da resposta "inalterado" e aumento de "diminuiu", em relação a D30, e, na D90, houve aumento significativo da resposta "aumentou" e queda das respostas "inalterado" e "diminui", em relação a D60, evidenciando, assim, recuperação do desempenho com o uso dos produtos nesse grupo B (Tabela 4, Figura 4).
Pela análise histológica das biópsias cutâneas, observamos que houve aumento da quantidade de fibras colágenas em 27,80% no grupo A e 19,40% no grupo B com significância estatística para comparação entre os grupos (p = 0,405). Para fibras elásticas, houve aumento de 16,70% para os grupos A e B. Em relação à mucina, o grupo B demonstrou aumento em 2,80% com significância estatística para comparação entre os grupos (p = 0,314) (Tabela 5, Figura 5).
Apesar de o mecanismo exato do envelhecimento cutâneo ainda estar pouco esclarecido, a redução da atividade imunomoduladora da pele com a progressão da idade é uma de suas maiores razões, assim como a redução no número e função dos fibroblastos, e destruição de importantes estruturas, especialmente colágeno, elastina e fibronectina.13,14
As alterações imunológicas ocorridas com a progressão da idade, além de ocasionar o envelhecimento cutâneo, também geram maior suscetibilidade à infecções e ao câncer, já que ocorrem mudanças da atividade imune; uma delas é a alteração da produção de citocinas, que, do padrão de pró-inflamatória (Th1) com produção de IL-1 , torna-se predominantemente antiinflamatória (Th2), com IL 10 como resposta humoral dominante, gerando imunossupressão exacerbada e redução do metabolismo dérmico e epidérmico, e consequente aceleração do processo de envelhecimento.13,14
Nos achados deste estudo, em sua fase in vitro, mesmo após a introdução de substância que simula o envelhecimento cronológico (LPS), viu-se que o complexo de fitoestrógenos favoreceu aumento da IL-1 , fazendo com que os níveis basais dessa citocina pró-inflamatória retornassem àqueles do controle, ou seja, iguais àqueles sem a introdução do simulador do envelhecimento (Gráfico 3). Além do mais, o composto também reduziu significativamente os níveis da citocina anti-inflamatoria IL- 10 nas culturas de queratinócitos humanos, mantendo com as concentrações de 0,2, 0,4, 0,8 e 1,6% valores similares aos do grupo-controle basal (redução de aproximadamente três vezes em relação ao LPS) (Gráfico 4). Isso demonstra potencial estímulo imunomodulador do complexo, o que favorece a homeostasia cutânea, a qual é fisiologicamente perturbada com o envelhecimento.
As fibras colagênicas que propiciam à derme estrutura íntegra e propriedade mecânica estão evidentemente diminuídas no envelhecimento.8 O aumento de pró-colágeno, causado pelo fitoestrógenos em questão, aponta para valia na reconstituição de pele envelhecida. Na análise histológica do estudo in vitro com coloração Sirius Red observou-se aumento na síntese de colágeno, melhores redensificação dérmica, preenchimento e organização da derme (Figura 3). O composto demonstrou capacidade de aumentar, de maneira significativa, a expressão relativa de mRNA para pró-colágeno nas concentrações de 0,2; 0,1 e 0,05%, tendo a maior concentração sido capaz de aumentar três vezes e meia a expressão do pró-colágeno (Gráfico 2).
Como se sabe, a capacidade de aumentar a expressão relativa de mRNA para pró-colágeno gera mais produção de colágeno funcional "de novo" através de reação enzimática: o prócolágeno é clivado na pele pela enzima pró-colágeno peptidase, convertendo-se em colágeno funcional de maneira diretamente proporcional.18 Os dados obtidos neste estudo clínico, demonstram que o uso de cosmecêuticos à base de complexos de fitoestrógenos podem contribuir fortemente na prevenção e reversão dos sinais do envelhecimento cutâneo, atuando de maneira direta e efetiva nesse ciclo enzimático.
A fibronectina além de exercer a capacidade de contrair e organizar o tecido conectivo, promove adesão celular na cicatrização, reepitelização e é ainda a principal responsável pela integridade da junção dermoepidérmica.9-11 Ela é um dos principais marcadores do envelhecimento, quando há aumento da degradação enzimática e redução significativa de sua quantidade e qualidade.10,12
O complexo de fitoestrógenos foi capaz de aumentar de maneira significativa a expressão de mRNA para fibronectina, em relação ao grupo-controle (Figura 1). Pela imunofluorescência, obteve-se aumento da intensidade fluorescente do sinal antifibronectina na JDE, mostrando efeito positivo do complexo sobre a restauração da integridade da JDE (Figura 1), alterada durante o envelhecimento cutâneo.
A expressão de fibronectina (na forma de mRNA), foi vista na incubação de queratinócitos humanos com o complexo de fitoestrógenos nas concentrações de 0,1%; 0,05%; 0,025% e 0,012%, tendo as duas últimas concentrações promovido a melhor resposta (aumento, aproximadamente, de 5,5 e sete vezes) (Gráfico 1).
Do ponto de vista clínico, observou-se resposta clínica favorável com o uso do produto, seja isoladamente, seja associado a outro cosmecêutico.(Figura 6)
Com o aumento da expectativa de vida, o envelhecimento cutâneo torna-se mais evidente, o que ainda é agravado pela exposição solar que danifica vários componentes das células com mudanças moleculares e morfológicas desses componentes. Isso gera a necessidade de condutas que possam minimizar esses efeitos indesejáveis, assim como sua prevenção.19
No estudo aqui conduzido, a reposta clínica favorável com o uso de fitoestrógenos na abordagem cutânea foi comprovada não só do ponto de vista in vitro, mas in vivo, através de técnicas clínicas, laboratoriais e instrumentais.
Pelos resultados obtidos, concluímos que o complexo em questão pode contribuir fortemente no tratamento do fotoenvelhecimento cutâneo, uma vez que reúne qualidades essenciais para a manutenção da qualidade da pele. Suas benesses não se restringiram aos achados in vitro, mas também extrapolaram para os clínicos, apoiados nas confirmações laboratoriais de complementação. Os achados histopatológicos das biópsias de pele de voluntárias que se submeteram ao regime terapêutico proposto são a comprovação cabal de que os resultados in vitro atingidos com o referido complexo são possíveis, obviamente respeitando as limitações fisiotemporais próprias da capacidade de resposta clínica do corpo humano frente a qualquer terapêutica.
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