Análise imunohistoquímica da pele fotoenvelhecida após tratamento com o ácido 5 delta aminolevulínico

Data de recebimento: 14/06/2011
Data de aprovação: 15/12/2011

Trabalho realizado no Hospital das clínicas da
Universidade de São Paulo (USP) - São Paulo
(SP), Brasil.

Suporte financeiro: Nenhum
Conflitos de interesse: Nenhum

Abstract

Introdução: O mecanismo de destruição da célula alvo na terapia fotodinâmica compreende a destruição celular direta, a injúria ao estroma vascular e a ativação do sistema imune.
Objetivo: Estudar a resposta imune da pele humana fotoenvelhecida ao tratamento com terapia fotodinâmica.
Métodos: Treze pacientes femininas foram submetidas a três sessões de tratamento com o ácido 5 delta aminolevulínico associado à luz de diodo de 630nm. Foi avaliada a resposta imunohistoquímica do sistema imunológico da pele por meio dos marcadores: anti-CD1a, anti-CD4+, anti-CD8+, anti-TNFa, anti-IFN¿ e anti-IL4; antes, 24 horas após a primeira sessão e 21 dias após a terceira sessão. Os dados foram analisados por meio de estatística descritiva: média, desvio padrão, valor mínimo e máximo, e mediana.
Resultados: 21 dias após o ultimo tratamento houve diminuição do número de linfócitos CD4 e CD8, aumento de interleucina 4 na epiderme e derme, diminuição do TNF-a na epiderme e aumento na derme. A população de células Langerhans e do INF-¿ não mudou.
Conclusão: Em relação ao sistema imune esta terapia não mostrou alteração das células de Langerhans e, por isso, pouca imunossupressão local. A apoptose dos linfócitos CD4 e CD8 foi evidenciada sugerindo que a terapia fotodinâmica possa ser útil em doenças inflamatórias. O estudo mostrou diminuição do TNFa na epiderme e aumento na derme além do aumento da IL4 em ambas, o que sugere resposta do tipo humoral neste protocolo, o que também pode ser evidenciado pela ausência do INF¿.

Keywords: FOTOQUIMIOTERAPIA, ÁCIDO AMINOLEVULINICO, ENVELHECIMENTO DA PELE

INTRODUÇÃO

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma perspectiva no trata- mento de tumores e atualmente está sendo empregada no trata- mento de doenças inflamatórias como psoríase, acne, hiperplasia sebácea, rosácea e mais recentemente o fotoenvelhecimento. 1-7 Baseia-se no acúmulo específico de um agente fotossensibilizante no tecido alvo que posteriormente é ativado pela luz, e na pre- sença de oxigênio forma o oxigênio singlet, responsável pela injú- ria da célula alvo. 1 O mecanismo de destruição da célula alvo compreende: destruição celular direta, injúria ao estroma vascular e ativação do sistema imune. 1 O papel da TFD é causar uma rea- ção citotóxica no tecido, mas uma resposta pós-TFD, envolvendo reação imune inflamatória; inata e adaptativa ocorre para auxiliar na erradicação bem sucedida de células residuais remanescentes. 8 Embora a reação imune seja menos importante que outros efei- tos no estágio de ablação celular, depois da terapia, seu papel pare- ce ser decisivo no controle de longa duração do efeito da terapia. 9

A TFD em alta intensidade destrói células imunes impor- tantes; já em baixa intensidade estimula o sistema imune. Por um lado, esse processo ocorre pela ativação de monócitos e macrófa- gos e produção de mediadores antiinflamatórios; por outro, ocor- re pela maciça atração de neutrófilos no lugar da inflamação, havendo um estímulo para a produção de mediadores específicos. 8,9

No tratamento dos tumores, os principais fatores que parecem estar envolvidos na indução dessa resposta é a expres- são de várias citocinas e outros genes importantes imunologica- mente. Entre as citocinas, cuja expressão foi relatada como sendo modulada pela TFD, estão principalmente, a IL6, IL10 e TNFa, além da IL1ß, IL2, fator estimulante de colônia de granulócitos, fator de crescimento epidérmico e a modulação da expressão de vários genes envolvidos em adesão celular e apresentação de antígeno. 8,9

MÉTODOS

Foram estudados, prospectivamente, treze pacientes, do sexo feminino, com idade entre 50 e 78 anos (média 64), os cri- térios de inclusão foram: pacientes do sexo feminino, fototipo I a IV, 10 presença de fotoenvelhecimento Grau I-IV, segundo a classi- ficação de Glogau. 11 Os critérios de exclusão foram: uso recente (um mês) de método abrasivo ou substância queratolítica; doen- ças sistêmicas e cirurgias recentes; tendência à formação de que- lóide e/ou cicatriz hipertrófica; câncer de pele; antecedentes pes- soais ou familiares de melanoma; uso de medicações fotossensibi- lizantes ou imunossupressoras. As pacientes assinaram um Termo de Consentimento Livre Esclarecido e o estudo foi conduzido conforme as diretrizes da Declaração de Helsinki de 2000.

As pacientes foram submetidas à biópsia na região pré- auricular direita. Esta foi localizada e minuciosamente medida do início ao final do lóbulo da orelha, dividida em 3 partes onde foi realizada cada biópsia. Na primeira região foi realizada a bió- psia antes do procedimento, na segunda a biópsia de controle 24 horas após a primeira sessão e na terceira região o controle 21 dias após a terceira sessão.

Foram realizadas três sessões de terapia fotodinâmica (PDT) e o intervalo entre as sessões foi de 15 dias. Após 24 horas da primeira aplicação foi realizada foto de controle e biópsia na segunda. Após 21 dias da terceira sessão foi realizada novamen- te foto e biópsia na terceira região. Para a aplicação do ácido 5- delta-aminolevulínico a pele da face foi previamente limpa com álcool e então o ácido 5-delta-aminolevulínico 20% foi aplica- do de forma homogênea com o bastão aplicador Levulan® KerastickTM (Stiefel, São Paulo, Brasil) O ALA foi mantido na pele da face por 2 horas e posteriormente irradiada luz com aparelho de LED (Light Emmitig Diodes) cuja intensidade de saída era de 3100 mw/cm2, intensidade óptica de 100 mw/cm2, com superfície ativa de 40x80mm emitindo luz com compri- mento de onda de 630 nm, por 10 minutos em cada hemiface. As pacientes foram orientadas em relação aos possíveis efeitos colaterais, fotoproteção, uso de produtos químicos sem autori- zação prévia, retorno nas datas estabelecidas e no caso de desca- mação, a não retirada da pele.

Os cortes histológicos da pele das pacientes, antes, 24 horas e 21 dias após o tratamento foram preparados em parafi- na e seguiram para a reação de imunohistoquímica segundo o método do complexo avidina-biotina-peroxidase. 12 Nesse últi- mo método, procedeu-se à incubação com os anticorpos primá- rios nas seguintes diluições: CD1 1/20, CD4 1/400 e CD8 1/50 (DAKO) e os outros anticorpos utilizados foram o IFN¿ 1/30 (RD Systems – código MAB285), IL4 1/20 (RD System - código AF-204-NA) e TNFa 1/20 (RD System – código AF-210-NA).

As lâminas, submetidas à imunohistoquímica foram ana- lisadas sob microscópio de luz Zeiss com objetiva de 20x e ocu- lar de 10x. A avaliação quantitativa (determinação de área, com- primento e contagem de partículas) foi realizada com auxílio de Sistema Analisador de Imagem (Kontron Eletronic 300, ZEISS). Todas as amostras foram avaliadas por dois investigadores inde- pendentes. Os dados quantitativos histomorfométricos, relativos ao número de células CD1 positivas e os dados semi-quantita- tivos da reação inflamatória, células CD4 e CD8 positivas e rea- ção positiva IL4, IFN¿ e TNFa foram analisados por meio de Estatística Descritiva: média, desvio padrão, valor mínimo e máximo e mediana. Os Testes Estatísticos foram realizados com auxílio do programa SigmaStat (Jandel Cientific, CA, USA), aceitando como nível de significância p<0,05.

RESULTADOS

Treze pacientes, com fotoenvelhecimento facial realiza- ram tratamento com terapia fotodinâmica e ALA tópico. Segundo a classificação de Glogau, 11 seis pacientes (1, 4, 9, 10, 11 e 12) apresentavam fotoenvelhecimento grau III (46,15%), cinco (2, 3, 5, 6 e 13) grau IV (38,46%) e duas (7 e 8) grau II (15,38%). A idade variou entre 50 e 78 anos (média 64). Em relação ao fototipo, duas pacientes (2 e 5) apresentavam fototi- po I (15,38%), cinco (1, 3, 6, 9 e 12) fototipo II (38,46%), cinco (4, 7, 10, 11 e 13) fototipo III (38,46%) e uma (8) IV (7,69%).

Os resultados da análise histológica, histomorfometria e imunohistoquímica do sistema imune apenas foram avaliados em 12 pacientes devido a problemas técnicos com a biopsia. A análise dos cortes histológicos submetidos à reação imunohistoquí- mica para anti-CD8 revelou células inflamatórias mononucleares CD8 positivas presentes ao redor de vasos e anexos na derme (Figura 1 A,B). A avaliação morfométrica foi semi-quantitativa e os resultados individuais de cada um dos casos estudados.

Comparando-se os três momentos estudados de um mesmo tratamento, pré, 24horas e 21 dias após a 3ª sessão, atra- vés do Teste Estatístico não paramétrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observamos haver diferença significante (H= 10,185, p=0,006). Para melhor especificar as diferenças, aplica- mos o método de comparação múltipla de Dunn, que revelou diferença altamente significante entre intensidade de células CD8 antes e pós-tratamento, com redução de células CD8 no pós-tratamento (Q=2,68; p<0,05). O gráfico 1 mostra os resul- tados em gráfico de barras, estando representado pela média dos valores dos casos estudados.

Em relação ao anticorpo CD4, para evidenciar os linfó- citos, a análise dos cortes histológicos submetidos à reação imu- nohistoquímica para anti-CD4 revelou células inflamatórias mononucleares CD4 positivas presentes ao redor de vasos e ane- xos na derme. A avaliação morfométrica foi semi-quantitativa.

Comparando-se os três momentos estudados do mesmo tra- tamento para células CD4+ na derme, por meio do Teste Estatístico não paramétrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observa- mos não haver diferença significante (H=4,821, p= 0,090).

Em relação ao anticorpo CD1, para evidenciar as células de Langehrans, verificamos que 24 horas após e ao final do tra- tamento com terapia fotodinâmica as células de Langerhans estão presentes na epiderme (Figuras 2 A,B).

A avaliação morfométrica foi quantitativa avaliando o número de células CD1+ por área de epiderme. A média e des- vio padrão foram: CD1 antes =0,000458±0,000151; CD1 24hs= 0,000429±0,000255; CD1 final= 0,000934±0,000810.

Comparando-se os três momentos estudados de um mesmo tratamento, pré – 24horas- pós para células CD1+ na epiderme, através do Teste Estatístico não paramétrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observamos não haver diferença significante (H=1,977, p=0,372).

Em relação ao anticorpo IL4, para evidenciar a intensi- dade de Interleucina 4, verificamos que o tratamento com tera- pia fotodinâmica torna presente a IL4 na epiderme (Figura 3) e na derme (Figura 4).

A avaliação morfométrica foi semi-quantitativa avaliando a intensidade da reação imunohistoquímica na epiderme e derme separadamente. Comparando-se a intensidade de IL4 na epiderme nos três momentos estudados de um mesmo trata- mento, pré, 24 horas-pós, através do Teste Estatístico não para- métrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observamos haver diferença significante (H=16,090, p<0,001). Para melhor especificar as diferenças, aplicamos o método de comparação múltipla de Dunn, que revelou diferença altamente significante entre intensidade de IL4 na epiderme antes e pós-tratamento, com aumento de IL4 no pós-tratamento na epiderme (Q=4,00; p<0,05). O gráfico 2 mostra os resultados em gráfico de barras, estando representado pela média dos valores dos casos estudados.

Comparando-se a intensidade de IL4 na derme nos três momentos estudados de um mesmo tratamento, pré, 24horas- pós, através do Teste Estatístico não paramétrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observamos haver diferença signifi- cante (H=13,77, p=0,001). Para melhor especificar as diferen- ças, aplicamos o método de comparação múltipla de Dunn, que revelou diferença altamente significante entre intensidade de IL4 na derme antes e pós-tratamento, com aumento de IL4 no pós- tratamento (Q=3,71; p<0,05). O gráfico 3 mostra os resultados em gráfico de caixas, estando representado pela média dos valo- res dos casos estudados.

Em relação ao anticorpo TNFa , verificamos que o tra- tamento com terapia fotodinâmica reduz a intensidade de TNFa na epiderme e aumenta a intensidade na derme.

A avaliação morfométrica foi semi-quantitativa avalian- do a intensidade da reação imunohistoquímica na epiderme e derme separadamente. Comparando-se a intensidade de TNFa na epiderme nos três momentos estudados de um mesmo trata- mento, pré, 24horas- pós, através do Teste Estatístico não para- métrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observamos haver diferença significante (H=12,895, p=0,002). Para melhor especificar as diferenças, aplicamos o método de comparação múltipla de Dunn, que revelou diferença altamente significante entre intensidade de TNFa na epiderme antes e pós-tratamen- to, com redução no pós-tratamento (Q=3,57; p<0,05). O gráfi- co 4 mostra os resultados em gráfico de caixas, estando repre- sentado pela média dos valores dos casos estudados.

Comparando-se a intensidade de TNFa na epiderme nos três momentos estudados de um mesmo tratamento, pré, 24horas- pós, através do Teste Estatístico não paramétrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observamos haver dife- rença significante (H=11,78, p=0,003). Para melhor especificar as diferenças, aplicamos o método de comparação múltipla de Dunn, que revelou diferença altamente significante entre inten- sidade de TNFa na derme antes e pós-tratamento, com aumen- to de TNFa no pós-tratamento (Q=3,61; p<0,05). O gráfico 5 mostra os resultados em gráfico de caixas, estando representado pela média dos valores dos casos estudados.

Em relação ao anticorpo IFN¿, verificamos não haver reação positiva tanto na derme como na epiderme nos três momentos de tratamento estudados (Figura 5 A e B).

A análise dos cortes histológicos submetidos à coloração de H.E. revelou células inflamatórias mononucleares presentes ao redor de vasos e anexos na derme. Comparando-se a inten- sidade de infiltrado inflamatório na derme nos três momentos estudados de um mesmo tratamento, pré, 24horas- pós, por meio do Teste Estatístico não paramétrico de Análise de Variância de Kruskal-Wallis, observamos não haver diferença significante (H=1,11, p=0,572).

DISCUSSÃO

Na histologia, após 5 a 15 minutos da TFD, ocorre vaso- dilatação e processo inflamatório agudo perivascular com neu- trófilos, eosinófilos e mastócitos perivascular, mas o tumor não apresenta alteração. 1,13 Um a três dias após ocorre degeneração vacuolar da basal com focos de necrose da epiderme, processo inflamatório agudo com neutrófilos perivascular e dispersos e invasão de neutrófilos na epiderme. A vasodilatação e edema na derme são proeminentes. Infiltrado neutrofílico agudo pode ser visto nas glândulas sebáceas e estas podem apresentar degenera- ção de seus núcleos. Neste período o tumor ainda não apresen- ta alterações. No terceiro dia, ocorre degeneração hidrópica da camada basal, edema intracelular dos queratinócitos e os núcleos se tornam hipercromáticos. O infiltrado inflamatório começa a apresentar características agudas e subagudas. No quarto dia, a necrose dos queratinócitos começa a resultar em degeneração reticular; tem inicio a necrose celular tumoral e inicia-se a rege- neração das glândulas sebáceas. No sétimo dia ocorre a regene- ração da pele que está completa 4-6 semanas pós TFD-ALA. Colorações específicas mostram reparação da zona subepidér- mica com fibras colágenas paralelas a epiderme, diminuindo a massa elastótica pré-existente. 13

A evolução das alterações histológicas neste trabalho foi igual às relatadas na literatura, onde se observou, em 24 horas, edema e vacuolização da camada basal e após 21 dias completa reestruturação da epiderme e neoformação de colágeno, mas a alteração do infiltrado inflamatório não foi significante. O pro- cesso inflamatório agudo que se forma após a TFD, não foi observado neste trabalho sugerindo que este talvez ocorra com maior freqüência no tratamento de tumores, onde o tempo de exposição ao ALA é maior e também na administração sistêmi- ca, sendo a tópica responsável pela destruição através da forma- ção do oxigênio "singlet".

Os marcadores imunológicos foram escolhidos com o intuito de se definir um perfil de imunidade celular e humoral neste tratamento.

O estudo da morfologia e do comportamento das célu- las de Langerhans após trauma térmico, exposição ao UV e trauma com fitas adesivas, mostra que estas desaparecem em 2 dias e retornam entre 11 e 15 dias. 14-16 Neste trabalho, o núme- ro de CD1 não apresentou alterações significantes, embora a maioria das pacientes apresentasse uma diminuição, este resulta- do concorda com os trabalhos citados na literatura, onde a alte- ração destas células ocorre conforme o grau de ablação do pro- cedimento.

A diminuição da contagem de CD8 após 24 horas da primeira sessão não foi significante, mas se tornou significante com 21 dias da terceira sessão. Esta redução não é obtida por Abdel-Hadyet al., 17 que encontra um aumento do CD8 nas áreas tratadas que apresentam uma resposta positiva em relação às áreas tratadas com resultado negativo. Por outro lado, Hryhorenko et al. 18,19 relatam que a PpIX se acumula nos linfó- citos ativados e Gad (2001) apud Bissonete20 relatam que após a TFD ocorre a apoptose destas células. Grebenova et al. 21 relatam diminuição de 75% nos linfócitos após a TFD. A diminuição da contagem das células CD4 não foi significante.

Esta diminuição da contagem das células CD4 e CD8 sugere uma apoptose dos linfócitos após a TFD, o que também é relatado com os trabalhos de Grebenova21 e Bissonette, 20 mas estes trabalhos se referem ao tratamento de tumores e não do fotoen- velhecimento, sobre o qual não há relatos de alterações do CD4 e CD8 na literatura. O aumento do CD8 relatado por Abdel- Hady, 17 pode estar relacionado ao controle da resposta celular pre- sente na neoplasia intraepitelial cervical e quando o tratamento apresenta uma boa resposta, o tumor perde este controle.

O TNFa é um importante mediador de inflamação cutânea e é expresso em todos os processos inflamatórios da pele. Está presente em dois tipos de reações principalmente, efei- tos pró-inflamatórios e indução da morte por apoptose. Os que- ratinócitos e fibroblastos dérmicos sintetizam grande quantida- de de TNFa. Neste trabalho o resultado da expressão de TNFa mostrou diminuição significante desta citocina na epiderme e aumento também significante na derme. O aumento dérmico poderia justificar o estimulo dos fibroblastos, o que é evidencia- do pelo aumento da fração de colágeno e fibra elástica, mas a sua diminuição na epiderme apenas pode ser justificada pelo aumento da IL4 na epiderme. O aumento da IL4 na derme pode não ter sido suficiente para inibição dos fibroblastos, já que não é a ação desta IL na derme, mas sim na epiderme. A apoptose das células CD4 e CD8 também pode estar relacionada ao aumento do TNFa na derme.

A ação da IL4 é no crescimento e diferenciação para as células Th2. Inibe a IL1, IL6 e TNFa, além da expressão do ICAM1. A expressão de IL4 promove o desenvolvimento da resposta Th2 que está relacionada com as respostas das células B. Neste trabalho houve aumento da IL4 na epiderme e derme, podendo sugerir uma resposta do tipo Th2.

Neste trabalho não houve expressão do IFN¿.A produ- ção do IFN¿ está restrita a célula "natural killer", linfócitos CD8, um subgrupo de linfócitos CD4, produzindo citocinas do tipo I (células Th1). Apresenta capacidade de modular a respos- ta imune, propriedades ativadoras dos macrófagos, aumenta a capacidade de apresentação de antígenos de células apresentado- ras e induz moléculas de adesão como ICAM1 e VCAM1. 14-16 O fato de não ocorrer a expressão do IFN pode estar relacionado à diminuição dos linfócitos CD4 e CD8 e aumento da IL4, que determina uma resposta Th2, enquanto o IFN¿, Th1.

Outras investigações no tratamento do fotoenvelheci- mento com a TFD-ALA serão necessárias na parte imunológica para melhor compreensão da modulação do sistema imune.

CONCLUSÕES

O estudo da pele humana fotoenvelhecida com três ses- sões de 20 minutos, com intervalo de 15 dias, de TFD-ALA tópico 20% Levulan® Kerastick, TM com aparelho de LED com comprimento de onda de 630 nm cuja intensidade de saída era de 3100mw/cm2, intensidade óptica de 100 mw/cm2, com superfície ativa de 40x80mm emitindo luz com comprimento de onda de 630 nm 10 minutos em cada hemiface apresentou após o tratamento:

As células de Langerhans não apresentaram alterações sugerindo pouca imunossupressão local pelo procedimento.

Houve diminuição significante na contagem da população de linfócitos CD8 e não significante na de CD4, sugerindo uma apoptose dos linfócitos. Houve diferenças significantes na expressão do TNF-a, que se mostrou diminuída na epiderme e aumentada na derme. Esse aumento na derme pode estimular o fibroblasto.

Houve aumento significante na expressão da interleuci- na 4, na epiderme e derme.

O IFN¿ não apresentou alterações neste protocolo o que pode estar relacionado com a apoptose dos linfócitos.

A expressão positiva da IL4 e negativa do IFN sugere uma resposta do tipo Th2.

O número de sessões (3), o intervalo entre elas, 15 dias, o tempo de exposição prévia de 2 horas, a concentração de 20% de ALA e o uso da luz vermelha de 630nm, mostraram-se efica- zes, neste protocolo, no tratamento do fotoenvelhecimento clí- nico, assim como na estimulação da síntese de colágeno, de fibras elásticas e no sistema imune.

Referências

1 . Skivka LM, Gorobets OB, Kutsenok VV, Lozinsky MO, Borisevich AN, Fedorchuk AG, et al. 5-aminolevulinic acid mediated photodynamic therapy of lewis lung carcinoma: a role of tumor infiltration with different cells of immune system. Exp Oncol. 2004;26(4):312-5.

2 . Uebelhoer NS, Dover JS. Photodynamic therapy for cosmetic applications. Dermatol Ther. 2005;18(3):242-52.

3 . Hong S-B, Lee M-H. Topical aminolevulinic acid-photodynamic therapy for the treatment of acne vulgaris. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2005;21(6):322-5.

4 . Horio T, Horio O, Miyauchi-Hashimoto H, Ohnuki M, Isei T. Photodynamic therapy os sebaceous hyperplasia with topical 5-aminolaevulinic acid and slide projector. Br J Dermatol. 2003;148(6):1274-6.

5 . Alster T. Hirsch R. Single-pass CO2 laser skin resurfacing of light and dark skin: extended experience with 52 patients. J Cosmet Laser Ther. 2003;5(1):39-42.

6 . Gold MH, Goldman MP. 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy: where we have been and where we are going. Dermatol Surg. 2004;30:1077-84.

7 . Nybaek H, Jemec GBE. Photodynamic therapy in the treatment of rosacea. Dermatology. 2005;211:135-8.

8 . Photodynamic therapy mediates immediate loss of cellular responsiveness to cytokines and growth factors. Cancer Res. 2003;63(13):3812-8.

9 . Korbelik M, Dougherty GJ Photodynamic Therapy-mediated immune response against subcutaneous mouse tumors. Cancer Res. 1999;59(8):1941-6.

10 . Glogau RG. Chemical peeling and aging skin. J Geriatric Dermatol.1994;2:30-5.

11 . Freedberg IM, Eisen AZ, Wolff K, Austen FK, Goldsmith LA, Katz SI, editors. Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine. 4a ed, McGraw Hill; 1993a. p. 797-803.

12 . Sampaio SAP, Rivitti EA. Dermatologia. São Paulo:Artes Medicas;1998. p.45-66.

13 . Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ. Imunobiologia. O sistema imune na saúde e na doença. 5a ed. Porto Alegre: Artmed Ed.;2002. p.319-61.

14 . Larsen CP, Steinman RM, Witmer-Pak M, Hankis DF, Morris PJ, Austyn JM. Migration and maturation Langerhans cells in skin transplants and explants. J Exp Med 1990;172(5):1483-93.

15 . Lukas M, Stossel H, Hefel L, Imamura S, Fritsch P, Sepp NT, et al. Human cutaneous dendritic cells migrate through dermal lymphatic vessels in a skin organ culture model. J Invest Dermatol. 1996;106(6):1293-9.

16 . Sugiura K, Shamoto M, Sakamoto N, Shinzato M, Osada A, Sigiura M, et al. It is true that, when Langerhans cells migrate from the skin to lymph node, they are transported via lymph vessels Dermatology. 2003;206(3):222-4.

17 . Hryhorenko EA, Oseroff AR, Morgan J, Rittenhouse-Diakun K. Antigen specific and nonspecific modulation of the immune response by aminolevulinic acid based photodynamic therapy. Immunopharmacology. 1998;40(3):231-40.

18 . Hryhorenko EA, Oseroff AR, Morgan J, Rittenhouse-Diakun K. Deletion of alloantigen-activated cells by aminolevulinic acid-based photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 1999;69(5):560-5.

19 . Grebenova D, Cajthamlova H, Bartova J, Marinov J, Klamova H, Fuchs O, et al. Selective destruction of leukaemic cells by photo-activation of 5- aminolaevulinic acid-induced protoporphyrin-IX. J Photochem Photobiol B. 1998;47(1):74-81.

20 . Abdel-Hady E-S, Martin-Hirsch P, Duggan-Keen M, Stern PL, Moore JV, Corbitt G, et al. Immunological and viral factors associated with the response of vulval intraepithelial neoplasia to photodynamic therapy. Cancer Res. 2001;61(1):192-6.

21 . Bissonnette R, Tremblay J-F, Juzenas P, Boushira M, Lui H. Systemic photodynamic therapy with aminolevulinc acid induces apoptosis in lesional T lymphocytes of psoriatic plaques. J Invest Dermatol. 2002;119(1):77-83.

22 . Tosca AD, Balas CJ, Stefanidou MP, Katsantonis JC, Georgiou SK, Tzardi MN. Photodynamic treatment of skin malignancies with aminolevulinic acid. Emphasis on anatomical observations and in vivo erythema visual assessment. Dermatol Surg. 1996;22(11):929-34.

23 . Fitzpatrick TB The validity and practicability of sunreactive skin types I through VI. Arch Dermatol. 1988;124(6):869-71.

24 . Hsu SM, Raine L, Fanger H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase tecchniques. A comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J Histochem Cytochem. 1981;29(4):577-88.

25 . Naumann M, Toyka KV, Mansouri T, Taleghani BM, Ahmadpour J, Reiners K, et al. Depletion of neutralizing antibodies resensitises a secondary non-responder to botulinum A neurotoxin. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1998;65(6):924-7.

26 . Miyauchi S, Hashimoto K. Epidermal Langerhans cells undergo mitosis durin the early recovery phase after ultra-violet B irradiation. J Invest Dermatol. 1987;88(6):703-8.

27 . Holzmann S, Koch F, Stroitzner P, Schmuth M, Janke K, Fritsch P, et al. Tape stripping leads to emigration of Langerhans cells from the epidermis, their entry into afferent lymphatics in vivo, and allows immigration of progenitors. J Invest Dermatol. 2000;114:228

28 . Kölgen W, Both H, van Weelden H, Guikers KLH, Bruijnzeel-Koomen CAFM, Knol EF, et al. Epidermal Langerhans cell depletion after artificial ultraviolet B irradiation of human skin in vivo: apoptosis versus migration. J Invest Dermatol. 2002;118(5):812-7.