Avaliação por biópsias de couro cabeludo da atividade de novo ingrediente ativo natural, o “Cellium® GC”, formulado em solução tópica de 210mg/mL

Recebido em 05/01/2011
Aprovado em 20/05/2011

Trabalho realizado no Ambulatório de
Dermatologia do Hospital das Clínicas da
Universidade de São Paulo (USP) – São Paulo (SP), Brasil.

Conflitos de Interesses: Doação de medicamentos pelo Leggacy HealthCare Laboratório.
Suporte Financeiro: Doação de medicamentos pelo Leggacy HealthCare Laboratório.

Abstract

Introdução: A alopecia androgênica é alteração progressiva do couro cabeludo com pou- cas opções terapêuticas. Justifica-se, portanto, a pesquisa de novas drogas de uso local ou sistêmico direcionadas ao controle desta patologia.Objetivo:Avaliar a tolerância e identi- ficar o mecanismo de ação do composto Cellium® GC no tratamento da alopecia androgênica.
Métodos: Estudo prospectivo e aberto em 20 portadores de alopecia androgênica. O produto foi utilizado no couro cabeludo duas vezes ao dia em regime domiciliar por 12 semanas consecutivas. Foram realizadas biópsias antes e depois do tratamento para avaliar as alterações da resposta imune cutânea, da proliferação celular e da atividade antiapop- tose.A avaliação da efetividade e do grau de satisfação dos pacientes foi realizada por meio de questionários.
Resultados: Dezenove voluntários do sexo masculino completaram o estudo, com grau médio de satisfação de 8,3/10.Análises imuno-histoquímicas das biópsias de couro cabelu- do revelaram aumento significativo da resposta imune cutânea depois do tratamento: 73,9% de aumento de células de Langerhans CD1A+ (p = 0,003, teste t pareado), 41,66% de aumento de Ki-67+,marcador de proliferação celular (p = 0,012), 89% de aumento de pro- teínas antiapoptóticas BCL-2+ (p = 0,001).O produto também foi bem tolerado e seguro.
Conclusões: Cellium® GC melhora as defesas imunológicas da pele e a proliferação dos queratinócitos, e confere satisfação aos voluntários no tratamento da alopecia androgênica.

Keywords: ALOPECIA, BIÓPSIA, QUERATINÓCITOS, MINOXIDIL

INTRODUÇÃO

A alopecia androgênica (AAG) é processo biologicamente natural sem impacto negativo sobre o estado clínico do ser humano sob circunstâncias normais, mas costuma ter impacto negativo sobre a qualidade de vida. Afeta mais de 50% dos homens aos 50 anos de idade¹ e também proporção significativa de mulheres. O desenvolvimento de AAG exige a interação de fatores genéticos e hormonais, tendo sido proposta etiologia multifatorial. ²

Há duas drogas indicadas para o tratamento dessa condição que possuem evidência científica:minoxidil e finasterida; conti- nua, porém, a pesquisa na busca de novas drogas com igual fina- lidade. ³

Foi desenvolvido novo ingrediente ativo (Cellium® GC), combinação ativa extraída de plantas e usada como solução tópi- ca para tratar perda excessiva de cabelos. Cellium® GC, na con- centração de 210mg/mL, tem eficácia comprovada em prevenir a perda de cabelos e promover seu crescimento. Estudo clínico prévio comprovou que o Cellium® GC 210mg/mL aumenta significativamente o número de cabelos na fase anágena, dimi- nui significativamente o número de cabelos na fase telógena, levando à normalização da proporção anágeno/telógeno depois de seis semanas de tratamento. ⁴ Além disso, outro estudo com pacientes do sexo masculino que apresentavam AAG, compro- vou que a aplicação tópica de Cellium® GC no couro cabeludo tem sido bem tolerada, com alto grau de satisfação quanto a sua eficácia. ⁵

Nesse contexto, tornou-se importante compreender o mecanismo de ação desse novo agente ativo.Quando testado in vitro nas células endoteliais, o Cellium® GC demonstrou esti- mular resposta de angiogênese6 e, em estudo in vivo, demons- trou aumentar significativamente a concentração de colágeno perifolicular. ⁵ No entanto, atualmente continua difícil ligar essas duas últimas atividades com a eficácia do medicamento ativo no crescimento dos cabelos e em sua perda, sendo necessárias, por- tanto, mais investigações.

O objetivo deste estudo foi identificar outros mecanismos de ação que pudessem ser responsáveis pela eficácia do Cellium® GC 210mg/mL no couro cabeludo de portadores de AAG. Investigou-se o efeito local do produto sobre as defesas imuno- lógicas cutâneas, a proliferação de queratinócitos e a atividade antiapoptose.

MÉTODOS

Desenho do estudo
Neste estudo aberto prospectivo e monocêntrico de 12 semanas, cada participante foi sua própria testemunha.

População estudada
Foram recrutados, no Ambulatório de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, de 14 de janeiro a 20 de junho de 2008, 20 voluntários com diagnóstico clínico de AAG. O estu- do foi realizado de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinki, e as análises laboratoriais de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais, definidas pelos regulamentos Inmetro.

Os critérios de inclusão foram: sexo masculino, pele de fototipo II e III de Fitspatrick, idade entre 20 e 40 anos, porta- dores de AAG, Classificação Norwood-Hamilton modificada de I a VII, sem tratamento corrente com minoxidil ou finasterida ou tratamento com essas drogas suspenso pelo menos cinco meses antes do recrutamento, sem modificações dos costumes capilares e do penteado durante o estudo.Os critérios de exclusão foram: sexo feminino, tratamento corrente com minoxidil ou finasteri- da ou tratamento suspenso no prazo de cinco meses antes do recrutamento, alopecia iatrogênica ou traumática, uso concomi- tante de outros tratamentos no couro cabeludo, dermatite sebor- reica, psoríase ou qualquer dermatite no couro cabeludo.

MÉTODOS

Cada voluntário assinou o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, tendo o estudo sido aprovado pelo Comitê de Ética do serviço. Foram planejadas duas consultas para exame clínico, coleta de dados e biópsia da pele do couro cabeludo: uma antes (S0) e uma 12 semanas (S12) depois do tratamento com Cellium® GC 210mg/mL.Também foram recolhidos, na S12, questionários preenchidos pelo investigador com base nas respostas orais dos voluntários e de suas famílias.

Os efeitos colaterais e a tolerância cosmética foram avalia- dos pelo investigador usando escala de 1 a 3 para intensidade e de 1 a 8 para exame dermatológico.

Foram realizadas biópsias da pele do couro cabeludo do vértice com punch de 4mm.As amostras foram fixadas com for- malina tamponada com fosfato (pH 7,2) em temperatura ambiente, durante 24 horas, e depois imersas em parafina. Os cortes de parafina foram corados com solução de hematoxilina e eosina para exame histopatológico.

Os cortes longitudinais de 3Ìm das biópsias foram proces- sados seguindo os métodos do complexo avidina-biotina-pero- xidase.7 Resumindo, após a desparafinização, os cortes foram hidratados e incubados por 20 minutos em H2O2 a 0,3% em metanol para reduzir a atividade da peroxidase endógena. Os cortes foram incubados por uma noite a 4°C com os anticorpos primários (Dako,Glostrup,Dinamarca) diluídos em solução sali- na tritamponada (TBS) contendo 0,5% de solução com albumi- na sérica bovina.Os anticorpos primários usados para esse estu- do foram:CD1A (célula de Langerhans),Ki-67 (proteína proap- tótica),HSP-47 (proteína), BCL-2 (marcador proteico de proli- feração celular). Os cortes foram então lavados duas vezes em TBS, depois incubados com anticorpo de cabra anticamundon- go/coelho biotinilado (dueto Strept AVComplex/HRP, Dako A/S K492, Glostrup, Dinamarca). Depois de incubação de uma hora a 37°C com o segundo anticorpo, os cortes foram incuba- dos com o complexo avidina-biotina-peroxidase (Vector Laboratories, Burlingame, Califórnia, Estados Unidos) durante 30 minutos em temperatura ambiente, desenvolvidos com dia- minobenzidina (Sigma, Barcelona, Espanha) e montados em Entellan (Merck 107961, Darmstadt, Alemanha). Foram em seguida contracorados com hematoxilina de Mayer durante dois minutos.Todos os cortes histológicos foram processados simul- taneamente para cada marcador. Os controles negativos foram cortes sem anticorpo primário. Os controles positivos foram cortes de outros tecidos com reações positivas para o anticorpo específico.

A análise microscópica foi realizada usando câmera Sony CCD ligada a microscópio óptico Zeiss Axioplan, sendo as ima- gens processadas pelo software Kontron 300 (Zeiss, Feldbach, Suíça). Dez campos diferentes foram aleatoriamente seleciona- dos, e a área da derme foi determinada por análise de imagens (ampliação de 200 x). Foi estabelecido, para cada lâmina, o nível limiar para reações imuno-histoquímicas, depois de realçar o contraste até o ponto em que as células foram facilmente iden- tificadas.A área ocupada pelas células foi determinada por reco- nhecimento densitométrico digital, ajustando-se o nível limiar de medida até a densidade cinza.

TRATAMENTO

O investigador forneceu a cada voluntário seu próprio tra- tamento em sua apresentação comercial (sem randomização, sem rotulação de código). Consistiu em dois frascos de vidro claro com 110mL com sistema de bombeamento contendo solução acastanhada (Legacy HealthCare Laboratory, Epalinges, Suíça). Especialmente, a solução contém 210mg/mL de Cellium® GC, combinação de princípios ativos extraídos de Allium cepa, Citrus Medica Limonum, Paullinia Cupana e Theobroma Cacao. O trata- mento iniciou-se no dia depois de S0, borrifando em casa, no couro cabeludo seco ou molhado, 1mL da solução tópica duas vezes ao dia aproximadamente em intervalos de 12 horas (dose diária total de 2mL) durante 12 semanas. Ensaios clínicos pré- vios ⁴ mostraram que a dose-alvo eficiente é de 1mL duas vezes ao dia.A avaliação da adesão ao tratamento foi feita pelo consu- mo do produto para cada paciente.

Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas através do teste t pareado, análise de variância unidirecional, teste de Kruskal- Wallis e teste de Tukey e o método de Dunnett, usando softwa- re SigmaStat (Jandel Corporation, Califórnia, Estados Unidos) para as análises imuno-histoquímicas. Os dados foram conside- rados significativos quando p < 0,05.

RESULTADOS

Foram recrutados 20 participantes no estudo. Sua média de idade foi de 32,5 anos (23 a 40). Cinco participantes recusaram ser biopsiados na S12, um dos quais não respondeu ao questio- nário de eficácia. Todos os participantes aplicaram a solução tópica duas vezes ao dia, como programado. O consumo diário médio de Cellium® GC foi de 1,45g (0,87 a 1,95g).

As análises dos questionários (n = 19) indicaram boa eficá- cia no crescimento de cabelos, conforme relatado pelos voluntá- rios, bem como por suas famílias.O grau de satisfação do produ- to pelos voluntários chegou à média de 8,3/10. A avaliação dos voluntários mostrou boa efetividade e aceitação cosmética, já que:
– 90% dos participantes observaram novo crescimento de cabelos;
– 63% a 73% dos participantes observaram crescimento mais rápido dos cabelos;
– 84% dos participantes observaram mais cabelos;
– 68% dos participantes tiveram sensações agradáveis depois da aplicação;
– 65% dos participantes classificaram o produto como bom ou muito bom.

Com referência à consideração de segurança, os exames dermatológicos do couro cabeludo na S0 e na S12 não mostra- ram reação adversa.

As biópsias da pele do couro cabeludo mostraram epider- me com espessura normal e infiltrado inflamatório de células mononucleares em tornos dos vasos e anexos (n = 15).Também se observou elastose na derme. São detalhadas a seguir as análi- ses histomorfométricas dos cortes de biópsias, quando processa- dos com os vários biomarcadores estudados, a saber, os anticor- pos para a detecção de células de Langerhans CD1a+, de célu- las Ki-67, de células HSP47+ e de células BCL-2+. Os dados apresentados incluem aumento das porcentagens com signifi- cância estatística e microfotografia dos cortes das biópsias.

A análise das células de Langerhans CD1A+ tem sido rea- lizada por meio da determinação da fração de células CD1A+ de Langerhans na epiderme. Houve aumento estatisticamente significativo de 73,9% da fração de células de Langerhans CD1A+ na epiderme depois do tratamento com a solução tópi- ca Cellium® GC 210mg/mL (p = 0,003, teste t pareado) (Tabela 1 e Figura 1). Esse resultado foi confirmado pelo teste de Kruskal-Wallis (p = 0,003).

A análise das células Ki-67+ foi realizada por meio de determinação da fração de células Ki-67+ na epiderme. Houve aumento estatisticamente significativo de 41,7% da fração de células Ki-67+ na epiderme depois do tratamento com a solução tópica Cellium® GC 210mg/mL (p = 0,012, teste t pareado) (Tabela 2 e Figura 2). Esse resultado foi confirmado pelo teste Anova (p = 0,003) e pelo teste de Tukey (p < 0,05).

A análise das células HSP47+ foi realizada por meio da deter- minação da fração das células HSP47+ na derme. Não se obser- varam diferenças estatísticas na fração de células HSP47+ na derme antes e depois do tratamento com a solução tópica Cellium® GC 210mg/mL (p = 0,938, teste t pareado) (Tabela 3 e Figura 3). Esse resultado foi confirmado pelo teste Anova (p = 0,942).

A análise das células BCL-2+ foi realizada por meio da determinação da fração de células BCL-2+ na epiderme.Houve aumento estatisticamente significativo de 89% da fração de célu- las BCL-2+ na epiderme antes e depois do tratamento com a solução tópica Cellium® GC 210mg/mL (p = 0,001, teste t pareado) (Tabela 4 e Figura 4). Esse resultado foi confirmado pelo teste de Kruskal-Wallis (p = 0,006), bem como pelo teste de Dunnett (p < 0,05).

DISCUSSÃO

A aplicação da solução tópica com Cellium® GC 210mg/mL duas vezes por dia ao longo de 12 semanas não foi seguida de aumento da resposta das proteínas do choque térmi- co ou da chaperona do procolágeno HSP47. Sabe-se que esta última proteína é expressa em células inflamatórias. Foram observadas apenas poucas células inflamatórias na derme durante o estudo. Esse resultado também foi observado por Keagle et al. ⁸ Isto é consistente com resposta de células inflamatórias observa- da no transcorrer do estudo com localização difusa de células HSP47+ na derme, principalmente em torno dos vasos. Os resultados do estudo também demonstraram que uma aplicação de 12 semanas da solução tópica de Cellium® GC 210mg/mL foi seguida de aumento das células de Langerhans que per- tencem ao sistema de defesa das células da pele. Além disso, observou-se aumento das células Ki-67+, que representa índice proliferativo.As células Ki-67+ da epiderme normal humana se restringem principalmente às camadas de células suprabasais. Neste estudo, observou-se que tais células se dispersavam por todas as camadas de células suprabasais ou se aglomeravam em áreas específicas, como também mencionado por Tilli et al. ⁹

Sabe-se que a BCL-2 é proteína citoplasmática fundamen- tal como reguladora da apoptose.A BCL-2 promove sobrevida das células por inibição dos mediadores necessários para ativação das proteases (caspases). ¹⁰ A BCL-2 pode representar mecanismo de sobrevida essencial para melanócitos normais, em correlação com sua derivação da crista neural. ¹¹ A regulação da sobrevida e da morte das células, em vários tipos celulares, incluídos os melanócitos, poderia envolver interação dinâmica entre os acel- eradores da apoptose, como Bax, e os repressores da apoptose, como BCL-2. ¹² A expressão exagerada de BCL-2 se associa à parada acelerada em G1 ou retardo da transição G1/S. ¹³ Na condição do estudo, observou-se aumento significativo da expressão de BCL-2 na epiderme, provavelmente envolvendo a atividade dos melanócitos. Esse resultado pode ser estendido às células dos folículos pilosos, de modo que o aumento da ativi- dade proliferativa, juntamente com a atividade antiapoptótica, pode promover o crescimento dos cabelos. No entanto, em condições de pele normal, verificou-se que o marcador de pro- liferação Ki-67 se associa significativamente ao marcador proapoptótico p53. Em pele com alta radiação solar UV, porém, Ki-67 se associa ao marcador antiapoptótico BCL-2. Esse dese- quilíbrio de sinalização proliferativa/apoptótica pode levar a epiderme disfuncional que permita proliferação aberrante. Em resposta aos agentes genotóxicos, p53 do tipo selvagem se acumula e induz apoptose. Sugere-se então investigar a expressão do marcador proapoptótico p53 quando for aplicado o tratamento com a solução tópica com Cellium® GC 210mg/mL.

CONCLUSÃO

Em vista dos resultados obtidos nas condições do estudo, a aplicação da solução tópica com Cellium® GC 210mg/mL duas vezes ao dia no couro cabeludo por 12 semanas consecutivas por 19 voluntários do sexo masculino com AAG, correspondendo ao estádio I a VII da Classificação de Norwood-Hamilton mod- ificada,mostrou dar satisfação aos participantes quanto ao cresci- mento dos cabelos, com grau médio de satisfação de 8,3/10. Além da avaliação subjetiva, análises imuno-histopatológicas de biópsias da pele do couro cabeludo revelaram aumento das defe- sas imunológicas da pele, da proliferação e das atividades anti- apoptose dos queratinócitos na derme e na epiderme.A análise completa das avaliações clínicas e subjetivas permite considerar bem tolerada, segura e eficiente essa combinação de ingredientes ativos extraídos de plantas e apresentada na forma de solução. Consequentemente, considera-se essa solução tópica com Cellium® GC 210mg/mL boa alternativa aos tratamentos da AAG.

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